孫華潤,翟亞軍,蔡 田,徐引弟,苑 麗,潘玉善,劉建華,吳 華,胡功政*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)是豬上呼吸道的一種常在菌,具有條件致病性,是豬Glasser病的病原菌,可引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等[1],是目前影響?zhàn)B豬業(yè)最嚴(yán)重的細(xì)菌病之一。豬副嗜血桿菌在環(huán)境中普遍存在,只感染豬,可以影響從2周齡到4月齡的青年豬,豬主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病,通常見于5～8周齡的豬,發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)50%。除了細(xì)菌直接感染外,豬群還常會由豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)病毒、豬流感以及豬呼吸道冠狀病毒等繼發(fā)感染[2]。

通過使用疫苗可以控制副豬嗜血桿菌病,但是已有報道表明血清型多樣性和大量無法分型的菌株對交叉保護(hù)性疫苗的研制存在負(fù)面影響[3]。目前副豬嗜血桿菌病的防治主要依靠抗菌藥物,但由于抗菌藥長期盲目的使用,HPS對臨床常用抗菌藥已產(chǎn)生不同程度的耐藥性,耐藥菌株的流行給該病的治療帶來了極大挑戰(zhàn),所以臨床上對其藥物敏感性進(jìn)行長期監(jiān)控已成為防治的關(guān)鍵[4]。作者于2015年10月～2017年5月從河南、湖北、山西等7個省分離鑒定了HPS 104株,觀察了這些分離菌株對12種抗菌藥物的耐藥表型,并采用ERIC-PCR方法對104株臨床分離株進(jìn)行了基因分型分析,旨在為副豬嗜血桿菌病的防治及抗菌藥物的合理使用提供理論依據(jù),為分析耐藥菌的流行特點,進(jìn)一步研究耐藥性、耐藥基因的傳播擴(kuò)散機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院、河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所、信陽農(nóng)林學(xué)院動物醫(yī)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院,以及江西、湖南、陜西、安徽、山西等代表性豬場送檢的疑似副豬嗜血桿菌典型病變的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等部位采集樣品323份。

1.1.2 主要試劑 新生小牛血清購自杭州四季青有限公司;煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD)購自Roche公司；2×PCR Taq Master Mix、ddH2O、DSTM2000 DNA Marker均購自康為世紀(jì)(北京)生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 巧克力平板(CAP)、胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)和胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

將高壓滅菌的TSA在室溫下冷卻至不燙手時,每100 mL加入0.01 g/mL NAD(經(jīng)0.22 μm濾器過濾)1 mL及新生小牛血清5 mL[5],混合均勻后傾倒平板備用。同樣對高壓滅菌的TSB,每100 mL加入0.01 g/mL NAD(經(jīng)0.22 μm濾器過濾)1 mL及新生小牛血清5 mL。

1.1.4 藥物 鹽酸四環(huán)素TET(含量85%，批號150608)由阜南諾偉康生物科技有限公司生產(chǎn);環(huán)丙沙星CIP(含量85%，批號150418)、氨芐西林AMP(含量90%,批號091008)、復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉SMD-TMP(質(zhì)量比5∶1,批號160720)均由河南大明獸藥有限公司生產(chǎn);林可霉素LN(含量82.5%，批號160326)由揚(yáng)州聯(lián)博藥業(yè)有限公司生產(chǎn);頭孢噻呋鈉CTX(含量95%，批號151108)由山東萊蕪泰康藥業(yè)有限公司生產(chǎn);頭孢喹肟鈉CTC(含量95%,批號151014)由河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司生產(chǎn);卡那霉素KM(含量98%，批號160622)、甲砜霉素THI(含量98%，批號160723)均由廣東粵農(nóng)獸藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn);痢菌凈MEQ(含量98%，批號150601)由山西省芮城縣第二獸藥廠生產(chǎn);酒石酸(單氫)沃尼妙林VAL(含量98.7%，批號150721)由北京康農(nóng)興牧科技發(fā)展中心生產(chǎn);紅霉素ERY(含量98%，批號150812)由廣州辛利達(dá)獸藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 在無菌條件下分別自肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等病料中取樣,劃線接種于巧克力平板,37 ℃培養(yǎng)20～24 h。觀察細(xì)菌的菌落形態(tài),挑取疑似菌落接于TSB(加0.1‰ NAD和5%血清)中。 經(jīng)多次劃線純化培養(yǎng),保存。從同一頭病死豬不同部位樣品分離的細(xì)菌計為同一個菌株。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 取菌液10 μL于干凈的載玻片上,自然晾干后進(jìn)行革蘭氏染色,在油鏡下觀察,并記錄細(xì)菌的菌體形態(tài)。另取菌液在TSA平板上劃線,并在平板上垂直接種金黃色葡萄球菌,37 ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h。使用分離菌的菌液作為PCR擴(kuò)增模板,利用Oliveira S等報道的上、下游引物(HPS F:5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′;HPS R:5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′)進(jìn)行16s RNA的鑒定[1],預(yù)期擴(kuò)增片段在831 bp左右。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括：2×PCR Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 7.5 μL,F 1 μL,R 1 μL,模板3 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,37個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.3 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法(CLSI,2013;CLSI,2016)[6-7],分別對河南、湖北、湖南、山西、陜西、安徽和江西等7個省份的臨床分離株進(jìn)行MIC測定,分析MIC分布,計算MIC50和MIC90,并對7個省的菌株對各類抗生素的耐藥率進(jìn)行SPSS顯著性差異分析。選用的12種抗菌藥物包括:四環(huán)素TET(MIC≥2為耐藥)、環(huán)丙沙星CIP(MIC≥2為耐藥)、林可霉素LN(MIC≥2為耐藥)、氨芐西林AMP(MIC≥4為耐藥)、頭孢噻呋CTX(MIC≥2為耐藥)、頭孢喹肟CFPM(MIC≥2為耐藥)、卡那霉素KM(MIC≥64為耐藥)、痢菌凈MEQ(MIC≥32為耐藥)[7]、沃尼妙林VAL(MIC≥64為耐藥)[7]、甲砜霉素THI(MIC≥8為耐藥)、紅霉素ERY(MIC≥16為耐藥)[8]、復(fù)方磺胺-5-甲氧鈉SMD-TMP(MIC≥4為耐藥)[9]。美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)系會(CLSI)中尚無副豬嗜血桿菌藥物敏感性測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。胸膜肺炎放線桿菌(App)與副豬嗜血桿菌的親緣性較近且均為豬呼吸道病的病原菌,所以本實驗的質(zhì)控菌株采用胸膜肺炎放線桿菌(App)ATCC27090,購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.2.4 基因組的提取 菌液用肉湯培養(yǎng)16～20 h,抽取1.5 mL菌液于離心管中,以12000 r/min離心8～10 min,棄去上清液,收集菌體(再次收集1.5 mL菌液,離心,棄去上清液,再次收集沉淀菌體),加入200 μL TE緩沖液懸浮沉淀2～5 min,使菌體溶解；接著置于浮漂上,100 ℃煮沸8～10 min,以12000 r/min再離心8～10 min,棄去沉淀,收集上清液(即提取的基因組DNA)于離心管中,作為PCR反應(yīng)基因組DNA模板,在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 ERIC-PCR分型 參考Appuhamy S[10]報道的ERIC-PCR基因分型方法,引物選用James V[11]報道的ERIC1(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)包括：2×PCR Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 7.5 μL,ERIC1 2 μL,模板2 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性30 s,49 ℃退火35 s,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。取5～10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察,使用NTSYSpc 2.1軟件對電泳條帶進(jìn)行分析[12],凡相似度大于85%者視為同一譜型,代表同一克隆株。根據(jù)不同耐藥菌株在不同譜型的分布情況,分析耐藥菌株間的遺傳關(guān)系。

1.2.6 菌株保存 副豬嗜血桿菌極易死亡,對臨床分離株及時凍干(10%脫脂奶混懸),于-80 ℃冰箱保存。

2 結(jié)果和分析

2.1 細(xì)菌分離純化、鑒定結(jié)果

分離菌株在TSA平板上長勢良好,可以看到濕潤、隆起,呈灰白色、半透明色、邊緣整齊、大小不一的菌落形態(tài)。在油鏡觀察下,細(xì)菌呈短桿狀,也有細(xì)長桿狀,單個或短鏈排列,無芽孢,為革蘭氏陰性菌,見圖1。

16s RNA的PCR擴(kuò)增片段預(yù)計在831 bp,擴(kuò)增結(jié)果證明分離臨床菌株為HPS,部分結(jié)果見圖2。

圖1 油鏡下的HPS革蘭氏染色形態(tài)

2.2 副豬嗜血桿菌分離結(jié)果及藥敏試驗結(jié)果

從7個省份323份疑似副豬嗜血桿菌典型病變的病料中分離出104株,分離率為32.2%，其中河南26株,湖北19株,江西13株,湖南10株,安徽13株,山西11株,陜西12株。藥敏試驗結(jié)果顯示:所有菌株都對痢菌凈和沃尼妙林敏感,而對其他抗生素有不同程度的耐藥性。對復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉的耐藥率最高(表1),為93.3%;其次是四環(huán)素、環(huán)丙沙星,耐藥率分別為51.9%、51.0%；對β內(nèi)酰胺環(huán)類的氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢喹肟的耐藥率分別為39.4%、5.8%和1.9%；對林可霉素、卡那霉素、甲砜霉素和紅霉素的耐藥率分別為26.0%、10.6%、13.5%、37.5%。

M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1:陽性對照;2:陰性對照;3～8:臨床分離株的PCR產(chǎn)物。

在供試的12種抗生素中,104株臨床分離株耐2～5種抗生素居多,達(dá)到69.2%；分別有4株、2株對6種、7種抗菌藥耐藥；只有4株不對任何一種抗生素耐藥；2株僅對四環(huán)素耐藥。具體情況見表2。

由于分離菌株對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、林可霉素、氨芐西林、紅霉素及復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉的耐藥率較高,所以分析HPS對這6種抗菌藥在7個省份之間的耐藥性差異。SPSS差異顯著性分析結(jié)果顯示:除河南省和湖南省間的紅霉素耐藥率差異達(dá)顯著水平(P=0.027<0.05)外,其它藥物在7個省份之間的耐藥率差異均不顯著(P>0.05),具體結(jié)果見圖3、表3。說明7個省份之間各類抗生素耐藥情況雖有一定的差異,但大多數(shù)差異不明顯。

2.3 ERIC-PCR分型結(jié)果

利用NTSYSpc 2.1軟件,對104株臨床分離株進(jìn)行ERIC-PCR分型,其中5株不能分型，99株可以分型,分型結(jié)果如圖4所示。對99株臨床分離株分型結(jié)果按80%的相似性可分為18個ERIC-PCR譜型。其中,包含菌株最多的譜型為XIII型，有25株;其次為VI型,有18株;最少的為I、IV、V、XIV、XVII、XVIII型，均只有1株；II、III、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XV、XVI型分別有2、2、9、13、13、2、2、4、3、3株。

表1 104株HPS臨床分離株的MIC分布

注:TET,四環(huán)素;CIP,環(huán)丙沙星;LN,林可霉素;AMP,氨芐西林;CTX,頭孢噻呋;CTC,頭孢喹肟;KM,卡那霉素;THI,甲砜霉素;MEQ,痢菌凈;VAL,沃尼妙林;ERY,紅霉素;SMD-TMP,復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉。下同。

表2 104株臨床分離株的耐藥種類

圖3 7個省份臨床分離株對6種抗生素耐藥的差異

表37個省份臨床分離株對6種抗生素的耐藥率%

省份四環(huán)素環(huán)丙沙星林可霉素氨芐西林紅霉素復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉河南46.265.434.642.357.7A92.3湖北47.442.121.142.136.889.5江西53.853.830.846.246.292.3湖南40.050.040.020.010.0A100.0安徽61.538.515.430.830.8100.0山西45.036.49.127.327.381.9陜西75.058.325.058.333.3100.0

注:“A”代表P<0.05,即差異顯著。

分離菌ERIC-PCR分型與對6種藥物耐藥表型關(guān)系的分析結(jié)果見表4,從中可以看出,除耐林可霉素的菌株較均勻地分布于12個ERIC-PCR型外,耐其它5種藥物的菌株大多集中(8株以上)分布于2個(氨芐西林)或3個ERIC-PCR型中,這表明本試驗中的耐林可霉素的菌株多數(shù)來自不同的克隆,其耐藥性可能以水平傳播為主；而耐其他5種藥物的菌株多數(shù)遺傳關(guān)系很近,來自同一克隆,只有少數(shù)來自不同的克隆。

3 討論

HPS為兼性厭氧菌,對營養(yǎng)要求苛刻,臨床分離難度大,因而對分離和培養(yǎng)的要求高。使用TSA和TSB含量高的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h內(nèi)即可長出肉眼可見的菌落,具有較高的分離率。我們于2015年10月到2017年5月,歷時近2年對7個省份323份疑似副豬嗜血桿菌典型病變的病料(病死豬肺臟、脾臟、淋巴結(jié))進(jìn)行了病原菌的分離,發(fā)現(xiàn)脾臟、淋巴結(jié)等部位較難分離,而病料在豬死亡后24 h內(nèi)送檢的,在死亡前有呼吸道癥狀并有肺臟病變的肺臟及氣管相對容易分離到該菌。文獻(xiàn)報道關(guān)節(jié)液、心包液病原菌分布度較高[13],相對容易分離,但這些部位送檢采樣較困難。本次試驗僅分離出HPS 104株,分離率較低(為32.2%),這可能與外省部分病料在豬死亡較長時間后送檢有關(guān)。故應(yīng)盡可能盡早采樣進(jìn)行細(xì)菌分離。

圖4 部分菌株的ERIC-PCR分型結(jié)果

抗菌藥物ERIC-PCR型IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXIXIIXIIIXIVXVXVIXVIIXVI-II四環(huán)素10110134832211113111環(huán)丙沙星0011117395132801001林可霉素011105251011612000氨芐西林11011101131000711210紅霉素000109292012902200復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉011101675101312313301

本次藥敏試驗結(jié)果顯示:所有分離菌株都對痢菌凈和沃尼妙林敏感,這可能與這2種藥物較少使用有關(guān),也顯示出沃尼妙林治療HPS感染的良好潛力。但分離菌株對其他抗生素均有不同程度的耐藥性,其中,高達(dá)93.3%的分離菌對復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉耐藥,這一結(jié)果高于國內(nèi)外研究報道的HPS對復(fù)方磺胺的耐藥率[14-16],說明復(fù)方磺胺對治療采樣豬場的HPS感染幾乎無實際價值。有半數(shù)以上的菌株對四環(huán)素、環(huán)丙沙星耐藥(耐藥率分別為51.9%、51.0%),另有20%以上的菌株對氨芐西林、林可霉素和紅霉素耐藥(耐藥率分別為39.4%、23.1%、37.5%),這些結(jié)果與國內(nèi)有關(guān)研究結(jié)果[14-15,17-18]相近或略高，但顯著高于國外的研究結(jié)果(0%)[16,19]。但分離菌對頭孢噻呋、頭孢喹肟、卡那霉素、甲砜霉素的耐藥率較低,這為豬場的合理化用藥提供了科學(xué)依據(jù)。因此臨床根據(jù)藥敏試驗結(jié)果合理選藥,能有效治療HPS感染。應(yīng)該看到,耐多種藥物的菌株比例較高(耐3種以上藥物的菌株占總分離菌的56%),最常見的耐藥譜是耐藥3～5種(表2),說明耐多種藥物的菌株較為普遍。本試驗對7省分離株的耐藥差異情況分析顯示:6種抗生素耐藥率的地區(qū)差異多數(shù)并不顯著(圖3、表3),這可能與規(guī)?；i場所用抗菌藥種類相近有關(guān)；但耐藥譜型并不相同,故不同地區(qū)豬場仍應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)耐藥性監(jiān)測,以及時調(diào)整日常治療用藥方案。

與腸桿菌科細(xì)菌對3代頭孢具有高的耐藥率不同,HPS分離菌對3代頭孢的耐藥率通常很低。在本試驗中，HPS分離菌對頭孢的耐藥率較低,分別有5.8%、1.9%的HPS分離菌對頭孢類的頭孢噻呋、頭孢喹肟耐藥,這與國內(nèi)外的有關(guān)研究報道[17,19]相似。但值得注意的是,目前已報道的嗜血桿菌屬細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺環(huán)類的耐藥機(jī)制,主要是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶(TEM-1、Rob-1)和染色體ftsI基因突變[20],但這兩種機(jī)制均不介導(dǎo)對頭孢類的耐藥性,故HPS對頭孢類耐藥的分子機(jī)制顯然值得重點研究。

細(xì)菌的基因分型(genotyping),亦稱分子分型(Molecular typing)或流行病學(xué)分型(epidemiological typing)，是研究耐藥菌之間遺傳相關(guān)性的重要手段,國外在研究細(xì)菌耐藥性或耐藥基因傳播擴(kuò)散中普遍應(yīng)用基因分型。細(xì)菌的基因分型方法很多,主要包括:隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列(RAPD)分析、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列PCR(ERIC-PCR)、基因外重復(fù)回文序列PCR(REP-PCR)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)和多位點核酸序列測定(MLST)等。PFGE和MLST結(jié)果準(zhǔn)確,被譽(yù)為分子流行學(xué)分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”[21],但耗時、費用高,PFGE還對技術(shù)設(shè)備的要求高,故限制了這兩種方法在臨床上的大規(guī)模應(yīng)用。RADP圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，并常有假陽性或假陰性結(jié)果。REP-PCR雖然操作方便快捷,但重復(fù)性差,有時分辨率低。本文選用的ERIC-PCR分型方法,具有操作簡單、成本低[22]、周期短、分辨效果較好、可重復(fù)性好、實驗設(shè)備易用等優(yōu)點,有利于基層進(jìn)行分子流行病學(xué)的監(jiān)測[23]。本試驗對104株臨床分離株進(jìn)行ERIC-PCR分型的結(jié)果顯示:除耐林可霉素的分離株幾乎均勻地分布在12種ERIC型中外,耐其他5種藥物的菌株有的比較集中地(8株以上)分布于2～3種ERIC型中,又有部分菌株均勻地分布在9～13種ERIC型中,尤其耐復(fù)方磺胺-5-甲氧嘧啶鈉的菌株高達(dá)45株集中分布在VI、IX和XIII型ERIC型中,說明耐上述藥物的菌株既有來自同一克隆的,又有來自不同克隆的,HPS對這幾種藥物的耐藥性既有垂直傳播又有水平傳播,而對林可霉素的耐藥性以水平傳播為主,對復(fù)方磺胺的耐藥性以垂直傳播為主。這為進(jìn)一步研究臨床分離株耐藥基因的傳播擴(kuò)散機(jī)制提供了重要的信息和有益參考。

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