張博

（遼寧省撫順市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心113006）

細(xì)菌耐藥性越來(lái)越成為公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)，四環(huán)素作為家禽養(yǎng)殖業(yè)的常用抗生素，其抗菌譜廣泛，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性菌均有抑制作用，但由于四環(huán)素的不合理使用，使得沙門(mén)氏菌等致病菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)。耐藥基因作為一種新型的污染物質(zhì)，與耐藥菌的傳播有直接關(guān)系，本文以禽源性沙門(mén)氏菌為研究對(duì)象，采用藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè)方法，分析了禽源性沙門(mén)氏菌對(duì)四環(huán)素的耐藥情況，為家禽養(yǎng)殖業(yè)合理使用四環(huán)素類(lèi)抗生素提供指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 樣品分離培養(yǎng)

從遼東地區(qū)選擇3個(gè)育成雞場(chǎng)，采集健康雞群非重復(fù)肛試子樣品，用生理鹽水稀釋并接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再通過(guò)麥康凱培養(yǎng)基分離出沙門(mén)氏菌。

1.2 藥敏試驗(yàn)

按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作[1]，對(duì)分離株采用微量稀釋法測(cè)定沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素的MIC值。沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素的耐藥和敏感折點(diǎn)分別為MIC≥16μg/ml和MIC≤4μg/ml， 測(cè)定濃度范圍為 0.5～16μg/ml，質(zhì)控菌株為大腸桿菌 ATCC 25922。

1.3 耐藥基因檢測(cè)

根據(jù)GenBank已發(fā)表耐藥基因序列，對(duì)分離株進(jìn)行4種四環(huán)素耐藥基因： tet（A）、 tet（B）、 tet（C）、 tet（D）檢測(cè)。根據(jù)Ng等[2]研究得到擴(kuò)增目的基因引物序列及目的片段長(zhǎng)度，引物由上海生工合成。PCR體系取模板 cDNA 2.0 μl， 10pmol/μl 上 下 游 引物各 1μl， 混合 Tag酶 9.5μl， 加入滅菌雙蒸水至25μl。PCR反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 30 s， 60℃30 s，72℃30 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，于3.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以檢測(cè)擴(kuò)增效果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本研究共分離鑒定沙門(mén)氏菌34株，通過(guò)對(duì)耐藥性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，有30株沙門(mén)氏菌對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，耐藥率為78.9%。

2.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30株四環(huán)素耐藥菌中， 對(duì) tet（A）、 tet（C）、 tet（B）均有檢出，tet（D）沒(méi)有檢出。其中檢出tet（A）的21株，檢出tet（C）的15株，檢出tet（B）的1株，檢出率分別為70%、50%和3.3%。tet（A）的檢出率最高，tet（D）的檢出率最低。 其中有 21株對(duì) tet（A）、 tet（C）、tet（B）3種基因全部檢出。

3 討論

沙門(mén)氏菌是典型的禽類(lèi)致病菌，四環(huán)素作為廣譜抗菌藥大量地應(yīng)用在沙門(mén)氏菌等細(xì)菌病的治療與預(yù)防上，由于其不合理的使用，導(dǎo)致沙門(mén)氏菌的耐藥性。本研究通過(guò)遼寧省東部從3個(gè)育成雞場(chǎng)分離鑒定出沙門(mén)氏菌34株，經(jīng)過(guò)藥敏試驗(yàn)得出其中30株對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生耐藥反應(yīng)，這說(shuō)明在臨床上治療禽沙門(mén)氏菌病時(shí)，應(yīng)適當(dāng)減少或取代對(duì)四環(huán)素的使用。通過(guò)基因檢測(cè)試驗(yàn)可以看出大部分對(duì)四環(huán)素耐藥的沙門(mén)氏菌都帶有四環(huán)素耐藥基因，其中tet（A）的檢出率最高，這是因?yàn)閠et（A）基因主要位于結(jié)合性質(zhì)?；蛘咿D(zhuǎn)座子上，在對(duì)四環(huán)素耐藥的沙門(mén)菌中廣泛分布，耐藥基因的高檢出率對(duì)細(xì)菌耐藥性的傳播有直接關(guān)系，因此，耐藥基因 tet（A）、 tet（C）、 tet（B）的傳播是造成沙門(mén)氏菌對(duì)四環(huán)素抗生素耐藥的主要原因。

[1]Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S18 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing [M].Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[2]Ng LK,Martin I,Alfa M,et al.Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes [J].Molecularand CellularProbes,2001,15（4）:209-215.