劉霞 高喬 陳明康 周婧 王旭

摘 要：?? 為研究MS-222對(duì)俄羅斯鱘（ Acipenser gueldenstaedtii ）幼魚血液生化指標(biāo)的影響，分別采用150、200 mg/L的MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚進(jìn)行麻醉，測(cè)定麻醉前、麻醉中和麻醉后（復(fù)蘇后）魚體血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、總蛋白（TP）、甘油三酯（TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）、總膽紅素（T-BIL）、尿素氮（BUN）等血液生化指標(biāo)和血清溶菌酶（ LZM）的活性。結(jié)果顯示，使用MS-222麻醉對(duì)俄羅斯鱘幼魚的大部分血液生化指標(biāo)均有顯著影響，且在高濃度下這種影響更加顯著。使用MS-222麻醉復(fù)蘇24 h后，低濃度條件下的俄羅斯鱘幼魚的大部分血液生化指標(biāo)（除了堿性磷酸酶和尿素氮）恢復(fù)至麻醉前，但高濃度條件下的俄羅斯鱘幼魚的血糖、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶尚未恢復(fù)至麻醉前水平。

關(guān)鍵詞： 俄羅斯鱘（Acipenser gueldenstaedtii）;? MS-222;血液生化指標(biāo)

?俄羅斯鱘（ Acipenser gueldenstaedtii ）又叫俄國鱘，是一種分布于里海、亞速海和黑海地區(qū)，具有溯河產(chǎn)卵習(xí)性的鱘科鱘屬魚類。俄羅斯鱘食用價(jià)值很高，其可食部分占總體重的64%，其熏制魚肉，魚卵制成的魚子醬廣受人們喜愛。其精巢可制成燒傷療藥，干制鰾可用來生產(chǎn)強(qiáng)力膠。因其生長速度快、適應(yīng)力強(qiáng)已成為中國重要的養(yǎng)殖鱘類之一 ?[1] 。MS-222學(xué)名3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽，它具有使用濃度低，入麻時(shí)間短，作用時(shí)間長，藥物代謝快，殘留少，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn) ?[2] ，是目前使用最廣泛的活魚運(yùn)輸麻醉劑 ?[3] ，近年來，國內(nèi)外學(xué)者用麻醉劑MS-222對(duì)多種魚 ?[4-5] 進(jìn)行了相關(guān)的麻醉研究。MS-222已通過美國食品和藥品管理局（FDA） 的認(rèn)可 ?[6] 。

血液生化指標(biāo)可以用來反映魚類的生理狀態(tài)及健康狀況。在魚類麻醉時(shí)，藥物主要經(jīng)過肝臟代謝、腎臟代謝發(fā)揮作用，因此麻醉可能會(huì)對(duì)魚類肝臟和腎臟功能造成影響 ?[7] 。本試驗(yàn)主要通過MS-222麻醉劑對(duì)俄羅斯鱘幼魚麻醉前、麻醉中和復(fù)蘇后相關(guān)的血液生理指標(biāo)的測(cè)定，評(píng)價(jià)這種麻醉劑對(duì)俄羅斯鱘肝臟和腎臟的影響，為MS-222麻醉俄羅斯鱘幼魚的麻醉機(jī)理與安全用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚

俄羅斯鱘幼魚，購自大連當(dāng)?shù)匾火B(yǎng)殖場(chǎng)，體重70.91±8.93 g，體長26.83±5.42 cm，體質(zhì)健康，無病，暫養(yǎng)于120 L水槽中正常攝食后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)前停食24 h。

1.2 試驗(yàn)用水

大連當(dāng)?shù)亟?jīng)24 h以上曝氣的自來水，水溫13 ℃，pH 7.6～7.8，DO>8 mg/L。

1.3 試驗(yàn)器材

溶菌酶檢測(cè)試劑盒 （購自南京建成生物科技公司）、40 L的深色塑料箱、一次性1 mL無菌注射器、冰盤、分析天平、冷凍離心機(jī)、2 mL離心管、不同規(guī)格的微量移液槍、冰箱、試管架、0.5 cm及1 cm比色皿、722分光光度計(jì)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 MS-222溶液的配制 ?準(zhǔn)確稱取所需質(zhì)量的藥品及相同質(zhì)量的碳酸氫鈉混勻，在燒杯中用玻璃棒攪拌加快溶解，待全部溶解后加入到有相應(yīng)體積水的40 L麻醉容器中，混勻后靜置待用。

1.4.2 試驗(yàn)分組 ?麻醉試驗(yàn)分為3組進(jìn)行：①對(duì)照組，無任何處理（不加入麻醉劑）;②濃度為150? mg/L（含等質(zhì)量的碳酸氫鈉）-A組;③濃度為200 mg/L（含等質(zhì)量的碳酸氫鈉）-B組。每組放入試驗(yàn)魚10尾。首先將對(duì)照組俄羅斯鱘幼魚撈出（麻醉前），進(jìn)行采血。將隨機(jī)選取的試驗(yàn)魚分別放入150、200 mg/L MS-222中，待魚體達(dá)到深度麻醉期 （判斷標(biāo)準(zhǔn)為試驗(yàn)魚對(duì)外部的刺激失去條件反射能力，沉底不動(dòng)，鰓蓋張合微弱） 后開始計(jì)時(shí)，維持麻醉狀態(tài)10 min后分別隨機(jī)撈出其中的5尾進(jìn)行采血 （麻醉中）。將每組中剩余的5尾放入到清水中進(jìn)行復(fù)蘇，24 h后進(jìn)行采血 （麻醉后）。

1.4.3 血液采集 ?血液采集方法：將試驗(yàn)魚撈出，放在干凈的紗布上，用1 mL注射器從尾部抽血，抽出的血液立刻轉(zhuǎn)移到2 mL離心管，室溫下靜置10 min后在離心機(jī)中12 000 r/ min，離心5 min，取上清液，分裝成3管進(jìn)行平行測(cè)定。選取測(cè)定的血清生化指標(biāo)包括血糖GLU、總膽固醇TC、甘油三酯TG、谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、總蛋白TP、堿性磷酸酶AKP、總膽紅素T-BIL、尿素氮BUN、溶菌酶LZM。

1.4.4 血清生化指標(biāo)測(cè)定 ?血清提取后放置在-20 ℃冰箱內(nèi)隔夜送往大連市體檢中心進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.5 血清溶菌酶（LZM）活性測(cè)定 ?由于俄羅斯鱘血清有顏色，故溶菌酶（LZM） 測(cè)定采用自身對(duì)照法，按照試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS19.0進(jìn)行處理，在單因素方差分析的基礎(chǔ)上采用Duncan多重比較分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以 P <0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中血糖（GLU）的影響

如圖1所示，A、B組麻醉中和麻醉后的GLU濃度除A組麻醉后外均不同程度高于對(duì)照組。A組麻醉中血糖顯著高于對(duì)照組（ P <0.05），A組麻醉后血糖含量稍低于對(duì)照組，差異不顯著（ P >0.05）;B組麻醉中血糖含量稍高于對(duì)照組，差異不顯著（ P >0.05），B組麻醉后血糖含量顯著高于對(duì)照組，差異顯著（ P <0.05）。

2.2 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中總膽固醇（TC）的影響

如圖2所示，A、B組麻醉中和麻醉后均不同程度與對(duì)照組存在差異。A組麻醉中總膽固醇含量略低于對(duì)照組，差異不顯著（ P >0.05），A組麻醉后高于麻醉中和對(duì)照組，差異不顯著（ P >0.05）;B組麻醉中總膽固醇含量高于對(duì)照組，但不顯著（ P >0.05）卻顯著（ P <0.05）高于B組麻醉后，B組麻醉后總膽固醇含量低于對(duì)照組，差異不顯著（ P >0.05）。

2.3 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中甘油三酯（TG）的影響

如圖3所示，A、B組麻醉中和麻醉后血清中的甘油三酯均低于對(duì)照組，除B組麻醉后其余差異都不顯著（ P >0.05）。A組麻醉中甘油三酯含量略高于麻醉后，差異不顯著（ P >0.05）;B組麻醉中甘油三酯含量顯著（ P <0.05）高于麻醉后的含量;B組麻醉后甘油三酯含量顯著低于對(duì)照組。

2.4 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活力的影響

如圖4所示，A、B組麻醉中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力均高于對(duì)照組，且A組與對(duì)照組差異顯著（ P <0.05）;A、B組麻醉中和麻醉后各自差異均不顯著（ P >0.05）;A組麻醉中與麻醉后均低于B組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力，差異不顯著（ P >0.05）。

2.5 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活力的影響

如圖5所示，A、B組麻醉中與麻醉后血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活力均高于對(duì)照組，且除B組麻醉后谷草轉(zhuǎn)氨酶活力顯著（ P <0.05）高于對(duì)照組外，其他都不顯著（ P >0.05）;A組麻醉中和麻醉后谷草轉(zhuǎn)氨酶活力差異不顯著;B組麻醉中顯著低于麻醉后谷草轉(zhuǎn)氨酶活力。

2.6 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中總蛋白（TP）的影響

如圖6所示，A、B組麻醉中與麻醉后總蛋白含量均高于對(duì)照組;A組麻醉中高于麻醉后總蛋白的含量，且差異不顯著（ P >0.05）;B組麻醉中的總蛋白含量高于麻醉后但不顯著（ P >0.05）。

2.7 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中堿性磷酸酶（AKP）活力的影響

如圖7所示，A組麻醉中與麻醉后以及B組麻醉中堿性磷酸酶活力與對(duì)照組存在顯著性差異（ P <0.05）;A組麻醉中堿性磷酸酶活力升高，高于對(duì)照組，A組麻醉后堿性磷酸酶活力降低，低于對(duì)照組;B組麻醉中堿性磷酸酶活力顯著降低，低于對(duì)照組，B組麻醉后堿性磷酸酶活力上升但仍低于對(duì)照組，差異不顯著（ P >0.05）。

2.8 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中總膽紅素（T-BIL）的影響

如圖8所示，A、B組麻醉中和麻醉后血清中總膽紅素含量與對(duì)照組差異不顯著（ P >0.05）;A組麻醉中與麻醉后總膽紅素含量幾乎不變;B組麻醉中血清總膽紅素降低，低于對(duì)照組，B組麻醉后血清總膽紅素含量升高與麻醉中含量差異顯著。

2.9 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中尿素氮（BUN）的影響

如圖9所示，A、B組麻醉中和麻醉后血清中尿素氮含量均低于對(duì)照組;A、B組兩組麻醉中尿素氮含量均低于麻醉后的含量，且B組差異顯著（ P <0.05）。

2.10 MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚血清中溶菌酶（LZM）活力的影響

如圖10所示，A組麻醉中血清溶菌酶活力顯著（ P <0.05）高于對(duì)照組，麻醉中和麻醉后差異不顯著;B組麻醉中和麻醉后溶菌酶活力與對(duì)照組差異不顯著（ P >0.05）。

3 討論

魚體血液中激素含量的升高是魚類對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)敏感指標(biāo)，脅迫還通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)引起體內(nèi)血液成分的變化，從而影響機(jī)體的防御機(jī)能。魚類主要的排泄器官是鰓和腎臟，當(dāng)血液流經(jīng)上述器官時(shí)通過不同的形式將代謝產(chǎn)物排出體外 ?[8] 。在麻醉類藥物的吸收和排泄的過程中可能會(huì)對(duì)腎臟的功能造成一定影響，所以可以通過測(cè)定代謝產(chǎn)物的來對(duì)腎臟進(jìn)行監(jiān)測(cè)。通常通過血液中尿素氮 （BUN） 的測(cè)定 ?[9] 來判斷麻醉類藥物對(duì)腎功能的影響。尿素的排泄主要通過腎小球?yàn)V過和腎小管分泌兩條途徑，而魚類通過鰓上皮對(duì)水的滲透性增加使尿量增加，而試驗(yàn)中B組血清尿素氮高于A組，可能由于大劑量的麻醉劑在麻醉初期加快了魚體新陳代謝，尿素含量增加;A、B兩組均顯著低于對(duì)照組，說明麻醉劑使其鰓動(dòng)頻率下降，減少鰓對(duì)外界水體交換，減少氧氣交換導(dǎo)致血液因缺氧而使組織血液酸化 ?[10] ，而24 h后血清中尿素氮含量仍然低于對(duì)照組，說明該濃度下的麻醉劑對(duì)魚體腎臟功能有一定的影響。

肝臟是動(dòng)物體內(nèi)最大且功能眾多的腺體器官，參與體內(nèi)代謝、解毒、消化吸收和免疫等過程 ?[8] 。肝臟為機(jī)體代謝的中心器官，麻醉類藥物的吸收和代謝會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生一定影響，而通過測(cè)定一些相關(guān)指標(biāo)和酶活性的改變來反映對(duì)肝臟功能的影響，本試驗(yàn)通過測(cè)定GLU、TC、TP、TG、T-BIL含量的變化和ALT、AST、AKP活力的變化來判斷對(duì)肝臟的影響 ?[11] 。

血糖 （GLU） 提供魚類機(jī)體能量的主要來源，在魚體中GLU能夠保持一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，能被分解成單糖也可被合成糖原貯存在肌肉和肝臟中，而在體內(nèi)分解葡萄糖的酶活性很低，很容易發(fā)生變化，其高低容易受到周圍環(huán)境等諸多因素的影響，一般來說，活動(dòng)性強(qiáng)的魚類較反應(yīng)遲緩或底棲性的魚類GLU值高，生活在靜水要比生活在流動(dòng)的水體的魚類要低 ?[12] 。試驗(yàn)結(jié)果顯示，麻醉中A組血糖含量顯著高于對(duì)照組，而B組卻不顯著，可能因?yàn)樵摑舛认侣樽韯?duì)魚體刺激性較大，因脅迫應(yīng)激使魚體消耗了大量的能量而使血糖維持在特定水平。B組麻醉后血清中血糖含量顯著高于麻醉中血清中血糖含量且顯著高于對(duì)照組，說明該濃度下麻醉對(duì)魚體肝功能糖原轉(zhuǎn)換方面產(chǎn)生了一定影響而在血清中富集;總膽固醇是指血液中的所有脂蛋白所含膽固醇脂總和，而肝臟是膽固醇脂合成和貯存的地方，據(jù)結(jié)果顯示，麻醉劑MS-222對(duì)魚體總膽固醇影響不顯著，B組麻醉后血清中總膽固醇含量顯著低于麻醉中但與麻醉前含量差異不顯著;甘油三酯可由肝臟和脂肪等組織合成，由結(jié)果顯示，麻醉劑在麻醉中血清中甘油三酯含量低于對(duì)照組，差異不顯著，A組麻醉后血清中甘油三酯含量能回到正常水平，而B組麻醉后24 h血清中甘油三酯含量顯著低于對(duì)照組，說明麻醉劑MS-222對(duì)甘油三酯有一定影響;血清中總蛋白含量的高低反應(yīng)了肝功能代謝的強(qiáng)弱，根據(jù)測(cè)定結(jié)果顯示，A組差異結(jié)果不顯著，說明該濃度下對(duì)魚體沒影響，而B組麻醉中顯著高于對(duì)照組，而24 h后返回正常水平，可見MS-222麻醉劑對(duì)魚體影響不大;總膽紅素為直接膽紅素和間接膽紅素的總和，由肝內(nèi)葡萄糖醛酸化得來，血清中的膽紅素大部分由衰老紅細(xì)胞被破壞后產(chǎn)生出來的血紅蛋白衍化而成。由測(cè)定結(jié)果顯示MS-222麻醉劑麻醉中和麻醉后血清的總膽紅素含量與對(duì)照組差異不顯著，A組麻醉中的總膽紅素略高于對(duì)照組，說明麻醉可能會(huì)加快細(xì)胞衰老。綜上，麻醉過程中麻醉劑影響了肝功能。

一般認(rèn)為，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）以及堿性磷酸酶（AKP）在機(jī)體的非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)AST和ALT又是氨基酸代謝過程中兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)氨酶，而血清中的堿性磷酸酶主要來源于肝和骨，是維持身體健康必須的酶 ?[13] 。ALT主要在催化α-酮戊二酸與天冬氨酸生成谷氨酸與草酰乙酸的反應(yīng)過程中起氨基轉(zhuǎn)移作用，而AST主要在催化α-酮戊二酸與丙氨酸生成谷氨酸與丙酮酸的反應(yīng)過程中起氨基轉(zhuǎn)移作用 ?[14] 。在魚類正常生理狀態(tài)下，血清中的AST和ALT活性很低，他們主要存在與細(xì)胞中。當(dāng)某些組織病變時(shí)，因細(xì)胞通透性增加而使細(xì)胞中的ALT和AST大量釋放到血液中，從而使血清中的這兩種酶活力升高，因此通常根據(jù)血清中這兩種轉(zhuǎn)氨酶活性的變化判斷肝臟等組織器官的健康狀況，這也是目前評(píng)定肝臟健康好壞的最具特異性和最廣泛應(yīng)用的兩個(gè)指標(biāo) ?[15] 。在本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ALT在低濃度的MS-222麻醉中顯著高于對(duì)照組，但于24 h后恢復(fù)至正常水平，且B組中ALT含量雖然高于對(duì)照組但差異不顯著，說明該濃度下麻醉劑在麻醉時(shí)對(duì)魚體中ALT影響不大;AST在A、B兩組中均高于對(duì)照組，但只有在高濃度的MS-222麻醉后AST顯著高于對(duì)照組及A組，說明高濃度MS-222對(duì)魚體中AST產(chǎn)生一定的影響;AKP在低濃度MS-222麻醉中顯著高于對(duì)照組，24 h后回歸正常水平，而高濃度組麻醉中顯著低于對(duì)照組，24 h恢復(fù)到正常水平，說明該濃度麻醉劑在麻醉時(shí)對(duì)魚體有一定影響但影響不大。

溶菌酶 （LZM） 是一類具有免疫保護(hù)作用的天然抗菌肽 ?[16] ，廣泛分布于動(dòng)物各種組織、血液和分泌物中，能破壞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致水分大量進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，使菌體崩解 ?[17] 。相對(duì)哺乳動(dòng)物而言，魚類溶菌酶更具廣譜抗菌活性，對(duì)大部分致病的革蘭氏陰性菌有強(qiáng)烈的殺菌作用，這在魚類的非特異性免疫過程中起著重要的作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，低濃度的MS-222麻醉俄羅斯鱘幼魚時(shí)，麻醉中血清中LZM活性顯著高于對(duì)照組，麻醉后回歸正常水平，而高濃度的MS-222麻醉俄羅斯鱘幼魚時(shí)，低于對(duì)照組且差異不顯著。表明低濃度的MS-222對(duì)俄羅斯鱘幼魚的免疫力具有一定的刺激作用，使其產(chǎn)生代償性應(yīng)激效應(yīng)，在一定劑量范圍內(nèi)可達(dá)到刺激效應(yīng)頂峰，可以提高免疫力;而高濃度的MS-222麻醉則將超出俄羅斯鱘幼魚的自身生理調(diào)節(jié)范圍，導(dǎo)致免疫力低于對(duì)照組，從而損害魚體產(chǎn)生免疫毒性。

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