陸玉建 石東里 吳濤

摘要：為探究氯化鎘（CdCl2）對(duì)本生煙草（Nicotiana benthamiana）幼苗生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，選用不同濃度的CdCl2處理本生煙草幼苗，測(cè)量其根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)，提取本生煙草幼苗總蛋白質(zhì)，利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度CdCl2對(duì)本生煙草幼苗的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用;高濃度CdCl2則抑制了本生煙草幼苗的生長(zhǎng)。當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)，幼苗的生長(zhǎng)開始受到抑制;CdCl2濃度大于1.5 mmol/L時(shí)，幼苗大量變黃枯萎。SDS-PAGE顯示，低濃度CdCl2可提高植物總蛋白質(zhì)的含量，而隨著CdCl2濃度的提高，本生煙草總蛋白質(zhì)的含量明顯下降。

關(guān)鍵詞：CdCl2;本生煙草（Nicotiana benthamiana）;幼苗;總蛋白質(zhì);SDS-PAGE

中圖分類號(hào)：S572? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）21-0087-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.021? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of CdCl2 Treatment on the Growth and Protein Expression Level of

Nicotiana benthamiana Seedlings

LU Yu-jian，SHI Dong-li，WU Tao

（College of Biological and Environmental Engineering，Binzhou University/Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta，Binzhou 256603，Shandong，China）

Abstract： In order to investigate the effects of CdCl2 treatment on the growth and protein expression of Nicotiana benthamiana，the seedlings were treated with CdCl2. The growth status of the seedlings was observed and the length of the root and stem was recorded. The protein of Nicotiana benthamiana were extracted by SDS extraction，and isolated by SDS-PAGE. A large number of experimental data showed that low concentration of CdCl2 could promote the growth of the seedlings，while the high concentration of CdCl2 inhibited the growth of the seedlings. When the concentration of CdCl2 reached 0.5 mmol/L，the growth of seedlings began to be inhibited. If the concentration of CdCl2 was greater than 1.5 mmol/L，the seedlings turned yellow and withered. SDS-PAGE showed that low concentration of CdCl2 could increase the total protein content of the plant，but with the increase of CdCl2 concentration，the total protein content of Nicotiana benthamiana significantly decreased.

Key words： CdCl2; Nicotiana benthamiana; seedling; total protein; SDS-PAGE

伴隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，重金屬對(duì)土壤的污染日益嚴(yán)重，已成為亟待解決的世界性難題。重金屬元素鎘（Cd）對(duì)生物體具有較強(qiáng)毒性，遷移性強(qiáng)且易積累[1，2]。Cd在土壤中主要是以化合物氯化鎘（CdCl2）的形式存在，當(dāng)濃度超過一定值時(shí)，生物體的生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)出了一系列的CdCl2毒害效應(yīng)[3，4]。土壤Cd污染對(duì)植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及植物體壽命有著重要的影響[5，6]。Cd能阻礙植物體葉綠素合成，影響植物對(duì)CO2的吸收和O2的排放能力，使其生物合成代謝能力下降[7-9]。當(dāng)土壤中Cd的含量不斷升高時(shí)，植物氣孔的開放受到抑制，從而影響植物的蒸騰作用以及光合作用，造成植物體內(nèi)的營養(yǎng)成分失調(diào)[10，11]。此外，Cd還可使植物中某些酶的活性喪失，破壞生物膜結(jié)構(gòu)或引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧自由基（ROS）增加，攻擊生物體中細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)[12-15]。Cd在生物體中不易分解和轉(zhuǎn)化，是一種極具危害性的土壤污染重金屬，能夠通過食物鏈逐級(jí)往上傳遞，并不斷富集[5，10，11]。Cd可在人體內(nèi)積累，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)以及消化系統(tǒng)等造成嚴(yán)重的傷害，具有極強(qiáng)的致癌、致畸作用，嚴(yán)重危害人類的健康[14]。近年來，重金屬Cd污染的治理已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題。土壤中的Cd主要是以Cd2+和螯合物的形式進(jìn)入植物根系細(xì)胞，利用H+/陽離子反向運(yùn)輸器、P1B-ATP酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中，經(jīng)共質(zhì)體運(yùn)輸進(jìn)入根莖中的木質(zhì)層、韌皮層以及中柱內(nèi)，通過蒸騰作用將其運(yùn)輸?shù)街参矬w其他的組織內(nèi)[16-18]。

目前，有關(guān)重金屬Cd對(duì)植物體的毒害機(jī)制尚不十分清楚。為此，本試驗(yàn)以模式植物本生煙草（Nicotiana benthamiana）為材料，采用不同濃度的CdCl2處理其幼苗，通過分析幼苗生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)表達(dá)情況，研究CdCl2對(duì)植物體的毒害效應(yīng)，以期為今后揭示相關(guān)的生理機(jī)制提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本生煙草種子，由山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心提供。

1.2? 方法

1.2.1? 本生煙草種子的消毒及培養(yǎng)? 取本生煙草種子，用0.1%的升汞消毒10 min，無菌水洗滌3～4次，接種于MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。本生煙草的生長(zhǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在25 ℃左右，光照度為2 000 lx。

1.2.2? 本生煙草幼苗的CdCl2處理? 取培養(yǎng)10 d的本生煙草幼苗，轉(zhuǎn)接到含不同濃度CdCl2（0、0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500和2.000 mmol/L）的MS基本培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行垂直培養(yǎng)。

1.2.3? 本生煙草幼苗根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的測(cè)量? 每天觀察幼苗生長(zhǎng)狀況，測(cè)量并記錄本生煙草幼苗在不同濃度CdCl2處理時(shí)根和莖的長(zhǎng)度，連續(xù)統(tǒng)計(jì)14 d。試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.4? 提取本生煙草幼苗的總蛋白質(zhì)? 取本生煙草幼苗，加入1 mL SDS提取液1（5%蔗糖，5% β-巰基乙醇，4% SDS）進(jìn)行研磨，靜置30 min。4 ℃，12 000 r/min離心15 min。取上清，加入8倍體積的丙酮，? ?-20 ℃靜置1 h以上。4 ℃，12 000 r/min離心15 min，留沉淀進(jìn)行干燥。加入50 μL SDS提取液2（5%蔗糖，5% β-巰基乙醇，4% SDS，1% NP-40）重懸沉淀，煮沸3 min。4 ℃，12 000 r/min離心5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5? SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)? 制備分離膠（T=10%）和濃縮膠（T=5%）。將蛋白樣品上樣。電泳初始電壓為100 V，樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)整為180 V。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色。加入脫色液進(jìn)行脫色，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶。觀察并拍照記錄。

1.2.6? 數(shù)據(jù)分析? 采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢測(cè)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? CdCl2處理對(duì)本生煙草幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

用不同濃度CdCl2處理本生煙草幼苗7 d后，觀察本生煙草幼苗的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比（圖1A），當(dāng)培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.125～0.250 mmol/L時(shí)，幼苗的生長(zhǎng)基本正常（圖1B、圖1C）;當(dāng)培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.500 mmol/L時(shí)，幼苗的生長(zhǎng)開始受到抑制，生長(zhǎng)速度下降（圖1D）;當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到0.750～1.000 mmol/L時(shí)，幼苗生長(zhǎng)遲緩，出現(xiàn)葉片枯黃或植株枯萎現(xiàn)象（圖1E、圖1F）;當(dāng)CdCl2濃度超過1.000 mmol/L，葉片枯黃和植株枯萎更為明顯，尤其當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到2.000 mmol/L，大部分本生煙草幼苗枯萎死亡，植株生長(zhǎng)受到明顯抑制（圖1G、圖1H）。

當(dāng)CdCl2處理本生煙草幼苗14 d后，0.250 mmol/L CdCl2處理幼苗的對(duì)照組（圖1I）和生長(zhǎng)情況（圖1K）基本相似;但0.125 mmol/L CdCl2處理的幼苗植株生長(zhǎng)要優(yōu)于對(duì)照組，表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用（圖1J）;當(dāng)培養(yǎng)基中CdCl2濃度達(dá)到0.500 mmol/L時(shí)，幼苗停止生長(zhǎng)，大部分植株葉片枯黃（圖1L）;當(dāng)培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.750～1.000 mmol/L時(shí)，幼苗植株個(gè)體小，大部分葉片枯黃和植株枯萎（圖1M、圖1N）;當(dāng)CdCl2濃度大于1.000 mmol/L時(shí)，葉片枯黃和植株枯萎現(xiàn)象更為明顯，隨著CdCl2濃度繼續(xù)增加，本生煙草幼苗全部枯萎死亡（圖1O、圖1P）。

2.2? CdCl2處理對(duì)本生煙草幼苗莖和根長(zhǎng)度的影響

對(duì)CdCl2處理7 d后的本生煙草幼苗的莖長(zhǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖2A所示。當(dāng)培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.125～0.250 mmol/L時(shí)，幼苗莖的長(zhǎng)度在0.7～1.0 cm，和對(duì)照組區(qū)別不大。其中CdCl2濃度為0.125 mmol/L時(shí)，莖的生長(zhǎng)速度稍快，接近1.0 cm。當(dāng)CdCl2的濃度大于0.5 mmol/L時(shí)，莖的長(zhǎng)度明顯遞減，和對(duì)照組差異顯著。尤其當(dāng)CdCl2濃度達(dá)到2.000 mmol/L時(shí)，和對(duì)照組差異極顯著。當(dāng)CdCl2處理14 d時(shí)（圖2B），0、0.125、0.250 mmol/L CdCl2濃度下本生煙草幼苗莖繼續(xù)生長(zhǎng)，長(zhǎng)度相近，生長(zhǎng)速度逐漸變慢;當(dāng)CdCl2濃度超過0.500 mmol/L時(shí)，其莖的伸長(zhǎng)基本停滯，長(zhǎng)度在0.4～0.6 cm，和對(duì)照組之間存在極顯著差異。通過分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，低濃度CdCl2對(duì)本生煙草幼苗莖的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但隨著CdCl2濃度的不斷增加，莖的長(zhǎng)度越來越短，生長(zhǎng)受到了明顯的抑制。

對(duì)CdCl2處理7 d后的本生煙草幼苗的根長(zhǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖2C所示。0.125 mmol/L CdCl2處理的本生煙草幼苗主根的長(zhǎng)度最長(zhǎng)，接近1.2 cm，生長(zhǎng)速度最快;0.250 mmol/L濃度下的本生煙草幼苗的主根長(zhǎng)度和對(duì)照組相似，長(zhǎng)度在0.9～1.0 cm;當(dāng)CdCl2濃度大于0.500 mmol/L時(shí)，其主根長(zhǎng)度明顯變短，和對(duì)照組之間存在極顯著的差異。當(dāng)CdCl2處理14 d時(shí)（圖2D），在0、0.125、0.250 mmol/L CdCl2濃度下，本生煙草幼苗根系繼續(xù)生長(zhǎng)。其中，當(dāng)培養(yǎng)基中CdCl2濃度為0.125 mmol/L時(shí)，幼苗主根生長(zhǎng)速度較快，長(zhǎng)度接近2.5 cm，和對(duì)照組之間差異極顯著。當(dāng)CdCl2濃度大于0.500 mmol/L時(shí)，其根系的生長(zhǎng)已基本停滯，長(zhǎng)度在0.4～0.6 cm，和對(duì)照組之間差異極顯著。上述結(jié)果表明，低濃度CdCl2可促進(jìn)本生煙草幼苗根的生長(zhǎng)，伴隨著CdCl2濃度的不斷增加，幼苗主根的長(zhǎng)度越來越短，生長(zhǎng)受到了抑制。

2.3? CdCl2處理對(duì)本生煙草幼苗蛋白質(zhì)含量的影響

不同濃度CdCl2處理本生煙草幼苗7 d和14 d后，利用SDS法提取幼苗植株總蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，分析蛋白質(zhì)含量的變化，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)CdCl2處理本生煙草幼苗7 d時(shí)，與對(duì)照組相比，0.125～0.500 mmol/L CdCl2處理的本生煙草幼苗其蛋白質(zhì)合成基本正常;當(dāng)CdCl2濃度大于0.500 mmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)合成受到明顯抑制，含量有所降低。當(dāng)CdCl2處理本生煙草幼苗14 d后，與對(duì)照組相比，0.125 mmol/L CdCl2處理下的幼苗其蛋白質(zhì)含量變化不明顯;0.250～0.500 mmol/L CdCl2處理的本生煙草幼苗蛋白質(zhì)含量明顯降低;CdCl2濃度超過0.500 mmol/L時(shí)，蛋白質(zhì)含量繼續(xù)減少，本生煙草幼苗蛋白質(zhì)合成受到顯著抑制。

3? 小結(jié)與討論

土壤中的多種重金屬對(duì)于植物體具有毒害效應(yīng)。CdCl2作為鎘的化合物存在于自然界中，危害著植物的生長(zhǎng)，是一種土壤中比較常見的重金屬污染物，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及生態(tài)平衡造成了不可估計(jì)的損失和影響[19，20]。為了研究CdCl2對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，試驗(yàn)中，利用不同濃度的CdCl2處理本生煙草幼苗，以觀察統(tǒng)計(jì)其根、莖的生長(zhǎng)狀況，并檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的變化。結(jié)果顯示低濃度的CdCl2對(duì)本生煙草幼苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而高濃度的CdCl2則抑制其生長(zhǎng)。當(dāng)CdCl2處理本生煙草幼苗7 d時(shí)，對(duì)照組和低濃度（0.125～0.250 mmol/L）CdCl2處理的幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)沒有明顯區(qū)別;但高濃度（0.500～2.000 mmol/L）CdCl2處理的幼苗生長(zhǎng)比較緩慢，植株矮小甚至出現(xiàn)了葉片枯黃的現(xiàn)象，和對(duì)照組差異比較明顯，尤其當(dāng)CdCl2濃度大于0.750 mmol/L時(shí)，幼苗的生長(zhǎng)受到了極大抑制，隨著CdCl2處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用愈發(fā)明顯。當(dāng)CdCl2處理本生煙草幼苗14 d時(shí)，隨著CdCl2濃度（0.500～2.000 mmol/L）的增加，葉片枯黃和植株枯萎的幼苗數(shù)量不斷增加，存活率降低，CdCl2對(duì)本生煙草幼苗的毒害效應(yīng)愈加明顯，其抑制作用愈加顯著。而低濃度（0.125～0.250 mmol/L）CdCl2處理的本生煙草幼苗則繼續(xù)生長(zhǎng)，尤其是在0.125 mmol/L的濃度下其根系生長(zhǎng)較快，長(zhǎng)度最長(zhǎng)，表明低濃度CdCl2對(duì)本生煙草生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)效應(yīng)。

通過SDS-PAGE分離不同濃度CdCl2處理時(shí)本生煙草幼苗蛋白質(zhì)并分析其含量變化，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著CdCl2濃度的升高，其蛋白質(zhì)條帶數(shù)目由多到少，顏色也由深變淺。而CdCl2處理幼苗時(shí)間不同，其蛋白質(zhì)合成以及含量也不同。隨著CdCl2處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)條帶數(shù)目由多到少，顏色也由深變淺。但0.125 mmol/L CdCl2處理的幼苗其蛋白質(zhì)含量和對(duì)照組沒有明顯區(qū)別。SDS-PAGE結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，不同處理時(shí)間、不同濃度CdCl2對(duì)本生煙草幼苗生長(zhǎng)發(fā)育有著不同的毒害效應(yīng)。試驗(yàn)初步分析了CdCl2處理對(duì)本生煙草幼苗生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)表達(dá)水平影響，研究結(jié)果可以為今后揭示鎘脅迫的生理機(jī)制以及污染土壤的植物修復(fù)提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳艷芳.莧菜品種重金屬Cd、Pb累積特性與根系重金屬關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)及生長(zhǎng)季節(jié)的關(guān)系[D].廣州：暨南大學(xué)，2015.

[2] 時(shí)? 萌，王芙蓉，王棚濤.植物響應(yīng)重金屬Cd脅迫的耐性機(jī)理研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2016（4）：504-512.

[3] 王松良.蕓苔屬蔬菜重金屬累積特性及抗Cd基因的差異表達(dá)與克隆[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2004.

[4] 蘇向楠.NO對(duì)Cd脅迫下紫花苜蓿幼苗氧化損傷與Cd積累的調(diào)控作用及其機(jī)制[D].蘭州：蘭州交通大學(xué)，2015.

[5] 張? 玲.擬南芥水楊酸突變體對(duì)Cd脅迫的應(yīng)答[D].沈陽：沈陽師范大學(xué)，2012.

[6] 姚詩音.超富集植物青葙對(duì)土壤鎘的修復(fù)性能及強(qiáng)化措施研究[D].廣西桂林：桂林理工大學(xué)，2017.

[7] 徐漢卿.商陸重金屬代謝相關(guān)基因響應(yīng)錳、Cd脅迫的表達(dá)分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[8] 韓承華.Cd、Pb、Cu、Zn對(duì)3種水生葉菜生長(zhǎng)的影響以及Se緩解效果的研究[D].江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2017.

[9] 羅? 婭，黃翔鵠，李長(zhǎng)玲.Hg-Cd聯(lián)合脅迫對(duì)卵葉喜鹽草光合色素和丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（4）：34-40.

[10] 李洪敬.氯化鎘對(duì)霞多麗（Vitis vinifera）幼苗生理影響及Cd的形態(tài)分布[D].重慶：西南大學(xué)，2011.

[11] CHIEN H F，KAO C H. Accumulation of ammonium in rice leaves in response to excess cadmium[J].Plant Sci，2000，156（1）：111-115.

[12] 陳忠翔.重金屬鎘脅迫細(xì)胞氧化毒理分子機(jī)制研究[D].上海：東華大學(xué)，2014.

[13] 李春喜，張志娟，張黛靜，等.Cu2+、Cd2+脅迫對(duì)小麥幼根SOD活性及其基因表達(dá)的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2011，13（4）：92-98.

[14] 于祎飛.土壤Cd污染及農(nóng)藝調(diào)控對(duì)蘋果樹體Cd積累影響的研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[15] 宋? 婕，王鶴潼，崔偉娜，等.Cd脅迫誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA損傷分析[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36（4）：635-642.

[16] 薛? 亮，劉建鋒，史勝青，等.植物響應(yīng)重金屬脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（4）：300-311.

[17] DALCORSO G，F(xiàn)ARIANTI S，MAISTRI S，et al. How plants cope with cadmium：staking all on metabolism and gene expression[J].Joumal of Integrative Plant Biology，2008，50（10）：1268-1280.

[18] 岳? 昊，楊友才.鎘對(duì)不同品種煙草生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（4）：76-79.

[19] 陳冬月.EDTA強(qiáng)化鹽生植物修復(fù)Pb、Cd與次生鹽漬化復(fù)合污染土壤[D].重慶：西南大學(xué)，2017.

[20] 趙淑玲，王? 瀚，王讓軍，等.Cd2+對(duì)花椰菜種子的萌發(fā)及幼苗生理生化的影響[J].種子，2018，37（1）：100-102.