田笑如 張毅

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，全球年新發(fā)肺癌患者約182.5萬人，死亡160萬人[1]，而中國年肺癌新發(fā)及死亡人數(shù)則分別為約78.1萬和62.6萬[2]。數(shù)據(jù)顯示肺癌患者5年生存率低至18%，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者則為5%[3]。究其原因，早期肺癌多無明顯臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)肺癌時(shí)已至晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，預(yù)后不佳。有研究表明I期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）肺癌患者5年總生存期（overall survival, OS）能達(dá)到73.5%-77.9%，5年無病生存（diseasefree survival, DFS）率為65.5%-72.7%[4]。因此，早期肺癌診斷對(duì)于提高肺癌早治率，降低患者死亡率非常重要。

目前臨床常用早期肺癌診斷方法包括血腫瘤標(biāo)志物、胸部X線片、胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）、纖維支氣管鏡、支氣管超聲引導(dǎo)下針吸活檢術(shù)、經(jīng)皮肺穿刺活檢等，在早期肺癌診斷方面表現(xiàn)出了很好的臨床效用，但或多或少存在敏感度差、準(zhǔn)確率低、成本高、周期長、有創(chuàng)等問題。因此研究一種敏感度強(qiáng)、特異性高、無創(chuàng)、簡單有效、成本低的診斷技術(shù)等具有重要臨床意義。拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)作為一種非侵入性微量物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異度好、快速有效等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥診斷方面表現(xiàn)出了良好的臨床應(yīng)用前景。本文通過復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，對(duì)拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)在肺癌診斷方面的應(yīng)用發(fā)展作一綜述。

1 拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的原理

拉曼光譜最早于1928年由印度物理學(xué)家Raman等[5]發(fā)現(xiàn)，是研究分子振動(dòng)的一種光譜學(xué)方法，它可以實(shí)現(xiàn)分子化學(xué)物質(zhì)的指紋識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)生物分子的無損檢測(cè)。在癌癥檢測(cè)方面，拉曼光譜可以探測(cè)到與癌變相關(guān)的微小分子層次變化，如核質(zhì)比增加、染色質(zhì)無序、高代謝活性、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)分子水平變化等，通過對(duì)比研究癌組織和正常組織的拉曼光譜，可發(fā)現(xiàn)其能反映組織病變信息的特征光譜，因此拉曼光譜技術(shù)可能實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的早期診斷，進(jìn)而指導(dǎo)早期治療。

然而，物質(zhì)自發(fā)拉曼光譜信號(hào)極弱，且極易受熒光干擾，靈敏度低，應(yīng)用范圍受到極大限制。表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)（surface enhanced raman spectroscopy, SERS）的出現(xiàn)解決了這個(gè)問題。SERS是通過吸附在金屬納米結(jié)構(gòu)表面上的分子與金屬表面發(fā)生的等離子共振相互作用而引起的拉曼散射強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象，是一種非常有效的拉曼信號(hào)檢測(cè)技術(shù)。SERS技術(shù)核心在于增強(qiáng)基底，一般SERS增強(qiáng)因子的平均值約為106，但是在納米粒子的間隙位置和尖銳突起外表面，局部增強(qiáng)可達(dá)到1014。然而目前SERS基底的穩(wěn)定性較差，而基底的細(xì)微差異就會(huì)使測(cè)量結(jié)果的變化很大[6]，目前仍無穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較高的增強(qiáng)基底[7]，仍不適于實(shí)際樣品中痕量目標(biāo)物的定量分析。為此，專家們進(jìn)行了大量探索研究，如開發(fā)不同增強(qiáng)基底[6,8-10]、表面增強(qiáng)納米修飾芯片[11]，開發(fā)磁輔助表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)[12]、共焦顯微拉曼技術(shù)[13]、表面增強(qiáng)相干反斯托克斯-拉曼散射技術(shù)[14]等。也有專家將拉曼光譜技術(shù)與內(nèi)鏡結(jié)合對(duì)病灶進(jìn)行實(shí)時(shí)照射活檢，也表現(xiàn)出不錯(cuò)的效果[15,16]。已有大量研究表明拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌[13]、結(jié)直腸癌[17]、宮頸癌[18]、前列腺癌[19]等癌癥的診斷。但是檢測(cè)技術(shù)穩(wěn)定性及重現(xiàn)性欠佳、底物預(yù)處理可能影響結(jié)果、檢測(cè)品類單一等問題仍未得到合理解決[7]。且對(duì)于液體樣品而言，檢測(cè)靈敏度仍不夠高，通常只能檢測(cè)濃度較高的溶液。

液芯波導(dǎo)增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)（liquid core waveguide enhanced raman spectroscopy, LOWERS）是通過使激光在液體/波導(dǎo)管界面上形成內(nèi)部全反射，使其通過樣品的有效光程遠(yuǎn)大于波導(dǎo)管的幾何長度，從而顯著提高信號(hào)強(qiáng)度、檢測(cè)靈敏度和探測(cè)極限。LOWERS是一種純光學(xué)增強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)液體樣品中不同物質(zhì)的同步痕量檢測(cè)，雖靈敏性略低于應(yīng)用最廣的SERS，但其穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于SERS。以非結(jié)晶無定形含氟聚合物（Teflon AF2400）制成的波導(dǎo)管能使LOWERS達(dá)到103量級(jí)的拉曼光譜信號(hào)放大，靈敏度和S/N也成比例增高[20]，尤其適用于水溶液特別是體液檢測(cè)。但當(dāng)波導(dǎo)管液體中因進(jìn)樣時(shí)隨機(jī)出現(xiàn)的氣泡使光路中斷時(shí)，增強(qiáng)效果會(huì)受到顯著影響，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果。為此，劉霽欣等[21]開發(fā)了負(fù)壓式LOWERS，可將Teflon AF管中氣泡經(jīng)由透氣的Teflon AF管壁抽出，避免其對(duì)LOWERS信號(hào)產(chǎn)生影響，該技術(shù)可對(duì)微升級(jí)液體實(shí)現(xiàn)100倍以上的穩(wěn)定增敏。

2 拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)診斷肺癌

2.1 肺組織拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)診斷肺癌的研究進(jìn)展 唐偉躍等[22]應(yīng)用共焦顯微拉曼光譜技術(shù)對(duì)肺癌及癌旁正常組織切片進(jìn)行分析，得出兩種組織的譜圖在峰頻移及峰強(qiáng)度方面表現(xiàn)出明顯差異：①正常肺組織切片的1,392/cm附近的C-H變形振動(dòng)在癌變組織光譜中向高波數(shù)移動(dòng)約6/cm；②1,523/cm脂類胡蘿卜素的C=C振動(dòng)譜帶在癌變組織光譜中向高波數(shù)移動(dòng)約3/cm；③在正常組織中1,610/cm處譜帶的強(qiáng)度明顯的強(qiáng)于1,526/cm處譜帶的強(qiáng)度，而在癌變組織中則正好相反。表明組織細(xì)胞在癌變過程中在構(gòu)型、構(gòu)象和數(shù)量上發(fā)生了變化，提示該方法在揭示惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及其他良性疾病的基礎(chǔ)研究中有著良好的前景。McGregor等[16]團(tuán)隊(duì)開發(fā)了快速實(shí)時(shí)內(nèi)鏡拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)和專用于肺部檢測(cè)的內(nèi)窺鏡拉曼導(dǎo)管，能使檢測(cè)時(shí)間縮短到1 s以內(nèi)[23]，結(jié)合自體熒光支氣管鏡+白光支氣管鏡技術(shù)，對(duì)后兩者篩查出的可疑區(qū)域進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，研究共檢測(cè)了80例病人的280例組織（包括72例高度異型性變或惡性病變組織及208例良性或正常組織），結(jié)果顯示其對(duì)高度異型性變和惡性病變的檢出具有高敏感度（90%）和很好的特異度（65%），檢測(cè)快速準(zhǔn)確。Weng等[14]采用相干反斯托克斯-拉曼散射技術(shù)結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法研究肺癌的自動(dòng)鑒別診斷，判別正常、小細(xì)胞肺癌、腺癌及鱗癌肺組織的準(zhǔn)確度能達(dá)到89.2%。然而肺組織樣本的獲取創(chuàng)傷大、成本高，實(shí)時(shí)內(nèi)鏡拉曼光譜技術(shù)操作復(fù)雜且創(chuàng)傷大，技術(shù)尚不成熟，仍需要大量研究以挖掘其在診斷肺癌及癌前病變方面的潛力。

2.2 呼出氣中揮發(fā)性有機(jī)物的拉曼光譜檢測(cè)診斷肺癌的研究進(jìn)展 人呼出氣中有超過3,000種揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds, VOCS），可能有助于早期肺癌檢測(cè)[24]。有研究[25-27]證明呼出氣中多種VOCS可作為肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物，有助于肺癌診斷。Zhang等[8]采用基于樹枝狀銀納米晶體的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，利用 “腔窩”效應(yīng)延長氣態(tài)分子在固體表面的反應(yīng)時(shí)間，通過與樹突狀銀納米晶體上預(yù)接枝的拉曼活性探針分子對(duì)巰基苯胺的親核加成反應(yīng)，能敏感地捕獲氣態(tài)醛分子，并實(shí)現(xiàn)十億分率水平的檢測(cè)。該方法對(duì)肺癌生物標(biāo)志物檢測(cè)的敏感性不受濕度的影響，這使其在快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、無創(chuàng)地判別肺癌方面具有很大的潛力。該團(tuán)隊(duì)也研究了采用基于ZIF-8涂層的金超粒子自組裝體的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)捕獲氣態(tài)醛，檢出限能達(dá)到100億分率水平，顯示了其在早期肺癌體外診斷方面的良好應(yīng)用前景[9]。VOCS拉曼光譜檢測(cè)無創(chuàng)、快速，在肺癌診斷方面表現(xiàn)出了良好潛力，但實(shí)際臨床效用仍有較大爭議，相關(guān)研究較少，但仍需進(jìn)一步研究探討。

2.3 唾液拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)診斷肺癌的研究進(jìn)展 唾液含有大量與體征相關(guān)的蛋白質(zhì)和分泌物質(zhì)，顯示出對(duì)多種疾病診斷的潛力[28]。李曉舟等[29]采用以銀膠為基底的SERS結(jié)合倒置顯微拉曼光譜儀檢測(cè)肺癌患者和健康人唾液樣本拉曼光譜，以主成分分析（principle components analysis,PCA）和線性判別分析對(duì)光譜數(shù)據(jù)降維和區(qū)分，結(jié)果顯示從對(duì)照組到肺癌組蛋白質(zhì)和核酸含量的整體下降，人肺癌腫瘤細(xì)胞的拉曼光譜也表明核酸和蛋白質(zhì)相對(duì)正常人的下降，表明唾液在某種程度上可以反映組織的狀況，判別肺癌的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性分別能達(dá)到84%、94%和81%，揭示了唾液SERS用于診斷肺癌的潛力。但是SERS檢測(cè)技術(shù)的穩(wěn)定及重現(xiàn)性不佳的問題仍未解決。Liu等[11]采用基于表面增強(qiáng)納米修飾芯片的便攜式拉曼光譜系統(tǒng)檢測(cè)分析肺癌患者和健康人唾液樣本，通過對(duì)特征峰的研究分析發(fā)現(xiàn)肺癌患者和健康人唾液中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和核酸分子種類及含量上明顯不同，建立的SVM模型和隨機(jī)森林模型判別肺癌的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度分別為100%、94.44%、98.3%和100%、88.8%、97.4%。唾液樣本獲取方便、完全無創(chuàng)，且在研究中表現(xiàn)出了高特異性、靈敏度及準(zhǔn)確度，但是該檢測(cè)系統(tǒng)依賴的芯片精度雖高但生產(chǎn)技術(shù)尚不成熟，不同批次芯片間的差異較大，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差。且唾液樣本易受痰液干擾，可能會(huì)使結(jié)果有所偏倚。

2.4 尿液拉曼光譜檢測(cè)在肺癌診斷方面的研究進(jìn)展 尿液中含有大約3,000種蛋白質(zhì)，是一種理想的蛋白質(zhì)和肽類生物標(biāo)記物研究樣本[30]。Niu等[31]采用氣相色譜/質(zhì)譜法對(duì)尿液樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)尿液中代謝產(chǎn)物共38種，其中有7種能有效指示肺癌，包括肌酐、肌醇、3-羥基丁酸、核苷酸、檸檬酸、十六酸、油酸，除了核苷酸在肺癌組下降外，其余6種物質(zhì)在肺癌組水平均高于其他肺部疾病組。也有大量研究表明尿液中GM2AP（GM2-activator protein）[32]、血漿銅藍(lán)蛋白[33]、肌酸核苷和N-乙酰神經(jīng)氨酸[34]、修飾核苷[35]等與肺癌有密切關(guān)系，有助于早期肺癌診斷。尿液分析完全無創(chuàng)、取材方便，尿代謝物生物標(biāo)志物作為無創(chuàng)臨床篩查工具對(duì)肺癌的早期診斷具有潛在的實(shí)用價(jià)值[36]。金剛烷胺的乙酰化在腫瘤細(xì)胞中明顯上調(diào)可用于癌癥尤其是肺癌的檢測(cè)，但由于其在尿液中濃度很低，一般方法難以檢測(cè)，有研究[37]采用基于有環(huán)式糊精包繞的金屬基底的SERS檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌患者尿液樣本中乙酰金剛烷胺的檢測(cè)，極限檢測(cè)濃度能達(dá)到1 ng/mL，且具有成本低、快速的優(yōu)點(diǎn)，有望成為臨床早期肺癌的診斷手段。此外，腺苷可能是一種癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物。人血清是一種含有蛋白質(zhì)的高度復(fù)雜的基質(zhì)，對(duì)腺苷的直接測(cè)定有嚴(yán)重的干擾作用，而尿液由鹽和小分子組成，如尿素和核苷，適于測(cè)定腺苷。Yang等[12]通過合成由植酸及其鹽編織并穩(wěn)定化的Fe3O4/Au/Ag納米復(fù)合材料，開發(fā)了磁輔助表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，檢測(cè)肺癌患者和健康人尿液樣本中痕量水平的腺苷，能達(dá)到1×10-10mol/L濃度的檢測(cè)水平，具有靈敏度高、選擇性好、預(yù)處理簡單、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地指示肺癌。但是尿中尿素可造成對(duì)腺苷檢測(cè)的嚴(yán)重干擾，雖然偶氮偶聯(lián)能成功去除尿中尿素，但也會(huì)嚴(yán)重干擾腺苷的SERS信號(hào)。這些研究證實(shí)了尿液拉曼光譜檢測(cè)診斷肺癌的優(yōu)勢(shì)及其可行性，具有良好的應(yīng)用前景。但是尿液中肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物的種類及含量仍無國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，尿液背景物質(zhì)對(duì)樣本拉曼信號(hào)的干擾仍未得到有效解決，且相關(guān)檢測(cè)技術(shù)不成熟，穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差的問題仍是限制其臨床廣泛應(yīng)用的瓶頸。

2.5 其他樣品拉曼光譜檢測(cè)診斷肺癌的研究進(jìn)展 Ye等[38]基于某些microRNA[39]可作為肺癌標(biāo)志物的研究，開發(fā)了基于循環(huán)指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）的SERS方法，可同時(shí)檢測(cè)肺癌中的多種microRNA，并能從高度同源的microRNA中區(qū)分出目標(biāo)microRNA，在臨床早期肺癌診斷中有很大的應(yīng)用潛力。Park等[40]利用SERS分別對(duì)NSCLC細(xì)胞和正常肺組織細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在實(shí)現(xiàn)肺癌的實(shí)時(shí)診斷，結(jié)合PCA判別肺癌細(xì)胞來源外泌體的敏感性和特異性分別能達(dá)到95.3%和97.3%（95%CI），證實(shí)了基于PCA的SERS無創(chuàng)檢測(cè)方法可實(shí)現(xiàn)判別NSCLC組織細(xì)胞來源的外泌體，從而可能實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的臨床診斷。近年來關(guān)于microRNA和外泌體等在肺癌診斷方面的研究如火如荼，但與拉曼光譜技術(shù)結(jié)合診斷肺癌的研究很少，給我們提供了新的思路。

3 結(jié)語

作為一種非侵入性檢測(cè)技術(shù)，拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)診斷早期肺癌具有操作簡單、快速有效、靈敏度及特異度高的優(yōu)點(diǎn)。拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展日新月異，結(jié)合不同組織細(xì)胞或體液樣本的研究，可實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的微創(chuàng)甚至無創(chuàng)檢測(cè)，在臨床早期肺癌診斷方面有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。研究開發(fā)穩(wěn)定性及重現(xiàn)性更好、靈敏度及特異度更高的拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)，降低樣本背景干擾對(duì)樣本拉曼信號(hào)的影響，結(jié)合不同拉曼光譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肺癌的微創(chuàng)甚至無創(chuàng)的高效檢測(cè)是今后科研工作者需要努力的方向。相信隨著相關(guān)研究的深入發(fā)展，拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)在臨床肺癌早期診斷中必將發(fā)揮更加重要的作用。