王巖青 余功富

(浙江省臺(tái)州市路橋區(qū)城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 318050)

畜禽的病毒病是獸醫(yī)臨床上最常見的疾病之一[1]，具有傳播速度快、死亡率高和易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)[2-3]，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)的影響較大[4]。畜禽抗病毒藥物指在畜牧養(yǎng)殖上用于禽流感預(yù)防和早期治療及豬傳染性胃腸炎防治的一類藥物[5]。在我國，抗病毒藥物曾被報(bào)道用于獸醫(yī)臨床治療病毒感染。農(nóng)業(yè)部禁止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用金剛烷胺等抗病毒藥物[6]，美國FDA同樣禁止金剛烷類和神經(jīng)氨酸酶抑制劑類抗流感病毒藥物用于禽類[7]。

目前，抗病毒藥物在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的非法使用屢禁不止，不法分子在獸藥、飼料和動(dòng)物保健品中添加抗病毒類化藥。因此，對(duì)畜禽用抗病毒藥物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行綜述，為有效監(jiān)測(cè)抗病毒藥物提供參考，把畜禽產(chǎn)品中抗病毒類化藥殘留風(fēng)險(xiǎn)降到最低，保障畜牧業(yè)健康有序發(fā)展。

1 抗病毒藥物殘留檢測(cè)

1.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (HPLC-MS/MS)

HPLC-MS/MS具有定性準(zhǔn)確的優(yōu)異性能，是近年來獸藥殘留檢測(cè)研究的主要方向[9]。已有抗病毒藥物殘留的檢測(cè)方法主要針對(duì)雞肉[8]、雞蛋[9]、豬肉[10]、肝臟[11]、腎臟[12]等可食性組織和畜禽糞便[13]等，檢測(cè)藥物主要是金剛烷胺、利巴韋林[14]、嗎啉胍及同類其他藥物[15]。

因抗病毒藥物大都含有氨基，屬于有機(jī)堿，在酸性溶液中易溶于水，在堿性溶液中易溶于有機(jī)溶劑，樣品前處理主要采用三氯乙酸、三氯乙酸+乙腈、三氯乙酸+甲醇、甲醇、乙腈等溶劑提取。該類藥物在提取液中主要以陽離子形式存在，提取后大多采用混合型陽離子交換柱 (MCX)、強(qiáng)陽離子交換柱(SCX)或親水親脂型離子交換柱 (HLB)固相萃取柱凈化。利巴韋林同時(shí)含有氨基和醇羥基，極性強(qiáng)，常見的固相萃取柱凈化效果不理想，采用苯硼酸型 (PBA)固相萃取柱凈化效果較好[16]。抗病毒藥物在進(jìn)行液相色譜分離時(shí)除少數(shù)使用C18色譜柱，多數(shù)使用親水性較強(qiáng)的Xamide、HILIC、ZIC-HILIC等色譜柱，以甲醇或乙腈+甲酸或乙酸銨水溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫為主要方式分離[17]。采用電噴霧正離子源和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行采集為主，以滿足確證的要求。采用通用QuEChERS法[18]進(jìn)行前處理，只能去除少部分雜質(zhì)。張?chǎng)蔚葘⑺幬锓謩e保留在強(qiáng)陽離子交換柱和石墨化碳柱上，并通過洗脫液置換，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)8種抗病毒藥物的方法，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)限低，實(shí)用性和創(chuàng)新性較強(qiáng)[19]。

1.2 超高效液相-飛行時(shí)間質(zhì)譜 (UPLC-Q-TOF)法

UPLC-Q-TOF能在寬質(zhì)量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高分辨，得到化合物的準(zhǔn)確分子量，進(jìn)而得到未知物質(zhì)的可能分子式等突出特點(diǎn)[20]，被廣泛應(yīng)用于藥物分析等領(lǐng)域[21]。鄒宇等利用該技術(shù)測(cè)定雞肉組織中的金剛烷胺[22]。樣品用1%三氯乙酸溶液-乙腈(1∶1)溶液超聲提取，經(jīng)固相萃取柱凈化濃縮，用Acquity UPLC BEH C18柱分離，以乙腈和0.1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子模式將樣品離子化，TOF MS/MS模式進(jìn)行檢測(cè)，提取m/z135.12的碎片離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片離子豐度比定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果金剛烷胺在5.91～147.75ng/ml。濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，檢出限 (LOD)為 4.9ng/g，定量限 (LOQ)為 9.8ng/g?；厥章试?1.8%～96.3%，精密度＜6.4%。

1.3 在線凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (TurboFlow)法

TurboFlow結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排除的原理，在捕獲分析物的同時(shí)快速凈化樣品，與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，在簡(jiǎn)化樣品前處理的同時(shí)保證了方法的靈敏度。艾連峰等研究該技術(shù)[23]。樣品用甲醇-1%三氯乙酸或乙腈提取，提取液用陽離子交換在線凈化柱 (Cyclone MCX)凈化，5%氨水-甲醇溶液將分析物洗脫轉(zhuǎn)入至Capcell Pak MG C18分析柱，經(jīng)色譜分離后，用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。方法的定量限 (LOQ)牛奶為0.25μg/kg，動(dòng)物組織和雞蛋為0.5μg/kg，在0.1～20μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)大于0.9995。方法在3個(gè)水平的添加回收率為83.3%～93.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.5%～5.9%。

2 獸藥和飼料中抗病毒藥物的檢測(cè)

獸藥和飼料中添加抗病毒藥物給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了安全隱患和損失。為了規(guī)范獸藥和飼料市場(chǎng)，農(nóng)業(yè)部不斷加大對(duì)獸藥和飼料處方外非法添加的打擊力度。目前用于獸藥和飼料中添加抗病毒藥物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜法等。

2.1 獸藥中添加抗病毒藥物的檢測(cè)

高效液相色譜配二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-PDA）是獸藥中抗病毒藥物確證和定量的重要手段。陳晨等建立了柴胡注射液中利巴韋林的檢測(cè)方法[24]。郝利華等建立了黃芪多糖注射液中利巴韋林的HPLC-PDA方法[25]。李樹綱等建立了高效液相色譜法檢測(cè)白龍散、黃連解毒散、蒼術(shù)香連散等7種獸用中藥散劑中利巴韋林的方法[26]。

LC-MS對(duì)添加物的檢測(cè)無歧視，能彌補(bǔ)HPLC方法中紫外檢測(cè)器的不足，并且合適的質(zhì)譜條件下可以獲得添加物的分子離子和碎片信息，對(duì)于推斷未知添加物尤為重要。因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在獸藥制劑中非法添加物的篩查與檢測(cè)方面的應(yīng)用也日益增多。高迎春等建立了檢測(cè)氟喹諾酮類藥物可溶性粉中利巴韋林的UP LC-MS/MS方法[27]?；ㄥ\等建立了獸藥制劑中違禁藥物金剛烷胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法[28]。劉雪紅等應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了獸用中藥制劑清瘟敗毒散中金剛烷胺的檢測(cè)方法[29]。魏秀麗等建立了多種抗菌藥物中非法添加利巴韋林檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法[30]。

2.2 飼料中添加抗病毒藥物的檢測(cè)

目前，飼料中抗病毒藥物檢測(cè)以氣相色譜和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為主。

張立華等采用石英毛細(xì)管柱DB-5Ms、程序升溫、FID檢測(cè)器檢測(cè)，建立了中獸藥散劑中金剛烷胺的氫火焰離子化氣相色譜檢測(cè)方法[31]。

周曉等建立了飼料中金剛烷胺的檢測(cè)方法[32]。試樣用甲醇-1%三氯乙酸提取，混合型陽離子交換小柱（MCX）凈化，上機(jī)測(cè)定。流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液，采用電噴霧離子源正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行測(cè)定和確證，以外標(biāo)法定量。吳劍平等建立了預(yù)混合飼料中7種抗病毒藥物含量的檢測(cè)方法，檢測(cè)的藥物為金剛烷胺、嗎啉胍、金剛乙胺、阿昔洛韋、利巴韋林、更昔洛韋和奧司他韋[33]。用乙腈提取，無水硫酸鎂脫水和鹽析，C18粉和丙基乙二胺凈化。使用親水作用色譜柱分離，流動(dòng)相為0.2%甲酸和乙腈，采用梯度洗脫，三重四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行定性定量分析。

3 小結(jié)

畜禽抗病毒藥物殘留檢測(cè)以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、高分辨-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為發(fā)展趨勢(shì)[34-35]。常量檢測(cè)主要采用HPLC-PDA法檢測(cè)獸藥和飼料中的抗病毒藥物。HPLC-PDA法用于有紫外吸收的藥物檢測(cè)，方便快捷，對(duì)于藥物本身沒有紫外吸收或有紫外吸收但組成成分復(fù)雜的藥物不能使用，這需要借助聯(lián)用技術(shù)。相信會(huì)有越來越多新穎的技術(shù)和先進(jìn)的儀器設(shè)備致力于解決畜禽組織基質(zhì)成分復(fù)雜、獸藥種類多等難點(diǎn)問題，增強(qiáng)檢測(cè)技術(shù)的實(shí)用性，使其能廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的日常檢測(cè)，為畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康提供保障。