壽艷紅 楊永生 徐金華

200040上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科

皮膚角質形成細胞（keratinocytes，KC）構成了抵御微生物侵襲的第一道防線，它具有嚴格的增殖與分化過程，構成了表皮的各個層次。細胞凋亡是一種主動、有序、由基因控制的細胞死亡方式，適度的細胞凋亡在皮膚穩(wěn)態(tài)中起重要作用。與凋亡不同，壞死被認為是不可控制的細胞死亡。隨著對細胞死亡機制的不斷深入研究，發(fā)現在某些情況下，壞死也是受一系列信號分子調控的、有序的過程。Degterev等［1］發(fā)現一種小分子物質Nec?1，能特異性阻斷由死亡受體信號通路引發(fā)的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）非依賴性細胞死亡，但不影響凋亡的發(fā)生，這種能被Nec?1特異性抑制的細胞壞死方式被命名為程序性壞死（necroptosis）。

一、程序性壞死的調控機制

1.程序性壞死主要的啟動因子：程序性壞死可由多種觸發(fā)因子誘發(fā)，包括腫瘤壞死因子α（TNF?α）、死亡受體（Fas）、TNF相關凋亡誘導配體、干擾素γ（IFN?γ）、脂多糖、DNA損傷、內質網應激、病毒感染等。TNF?α是一種多功能細胞因子，對細胞的作用復雜，并且在大多數情況下導致核因子κB（NF?κB）途徑激活。但根據細胞種類和內環(huán)境不同，TNF?α也可通過與其受體結合，使TNF受體相關死亡結構域（TNF?receptor associated death domain，TRADD）向受體相互作用蛋白激酶 1（receptor interaction protein kinase 1，RIP1）發(fā)出信號，募集受體相互作用蛋白激酶3（receptor interaction protein kinase 3，RIP3）形成壞死體后，通過激活混合系激酶區(qū)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain?like protein，MLKL）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等下游因子執(zhí)行程序性壞死［2］。

2.RIP1在程序性壞死中的作用：RIP1是Fas、TNF?α等誘導程序性壞死所需的第一個蛋白質，具有3種結構域：N末端是絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶結構域，用于磷酸化并調節(jié)底物；C末端為死亡結構域，募集Fas相關死亡域蛋白（Fas?associated with death domain protein，FADD）和caspase?8；N末端和C末端之間是一段中間結構域，其靠近C末端處為同型作用結構域（RIP homotypic interaction motif，RHIM），介導同源作用，可與其他含RHIM的分子互相作用［3］。在TNF?α刺激下，RIP1結構域各自發(fā)揮不同的作用，參與形成復合物Ⅰ、復合物Ⅱ和壞死體，執(zhí)行不同的功能。RIP1與TRADD通過死亡結構域結合后，募集TNF受體相關因子、凋亡抑制因子等構成復合物Ⅰ，該復合物通過募集NF?κB組成IκB激酶復合物調節(jié)劑等，導致NF?κB途徑激活，促進炎癥信號的傳導。TRADD從復合物Ⅰ上解離后，募集FADD和caspase?8形成復合物Ⅱ，引起細胞凋亡［4］。當復合物Ⅱ中的caspase?8失活時，具有激酶活性的RIP1募集RIP3，并通過各自的RHIM相互作用，形成壞死體，引發(fā)程序性壞死［5］。

3.程序性壞死特異性蛋白RIP3：RIP3是RIP1的同源激酶，具有相似的N端激酶結構域，過表達時可以促成NF?κB活化的中間結構域；其C末端還含有RHIM結構域，但與RIP1相比缺乏C端死亡域。在敲入突變的Ripk3D161N/D161N基因小鼠中，RIP3激酶失活，程序性壞死被抑制，提示RIP3激酶是誘導程序性壞死所必需的［6］。RIP3在賴氨酸處K63泛素化可促進RIP1和RIP3通過RHIM結合［7］，導致RIP3磷酸化，從而募集下游蛋白MLKL［8］；而小鼠巨細胞病毒可以激活另一個含RHIM結構域的干擾素調節(jié)因子的DNA依賴性激活因子，與RIP3的同型RHIM相互作用，引起RIP3依賴性程序性壞死，該過程中并無RIP1參與［9］。因此，相較于RIP1，RIP3在程序性壞死中更具有特異性。

4.程序性壞死的執(zhí)行者：研究發(fā)現，MLKL敲除小鼠與RIP3敲除小鼠具有相似的抵抗程序性壞死的能力［10］，提示MLKL參與程序性壞死的進程。磷酸化MLKL信號可以被Nec?1（RIP1激酶活性抑制劑）阻斷，但不能被NSA（MLKL功能抑制劑）阻斷，且RIP1信號表達不受NSA影響，說明MLKL的作用位于RIP1/RIP3的下游［11］。因此推測，MLKL是程序性壞死的執(zhí)行者。MLKL是一種有激酶結構域、但無激酶活性的假激酶［12］，通過其C末端假激酶結構域結合RIP3后被磷酸化［11?13］。Wang等［11］分析不同時間段細胞提取物，磷酸化的MLKL開始存在于細胞質中，后逐漸在膜上出現，提示MLKL磷酸化后從細胞溶膠轉移至膜上，對細胞膜進行滲透、破壞后導致細胞死亡。

MLKL下游調控機制仍不明確，除MLKL破壞細胞膜完整性的假設外，也有研究認為ROS執(zhí)行細胞死亡［14］。小鼠成纖維細胞L929中，在TNF?α刺激下，RIP3能夠激活關鍵代謝酶，導致能量代謝增加，隨后產生大量ROS，包括O2?、H2O2等［14］。ROS在MLKL活化的上游和下游都起作用，一方面，ROS促進RIP1/RIP3壞死體穩(wěn)定，啟動正反饋擴增循環(huán)［15］；另一方面，過度產生的ROS可以損傷脂類、蛋白、DNA等，影響Ca2+濃度，引起細胞壞死。另外，活性氮、神經酰胺等也可能執(zhí)行程序性壞死［16］。

二、KC及相關疾病與程序性壞死

HaCaT細胞（永生化角質形成細胞株）和原代KC中，胰蛋白酶抑制劑對硝普鈉誘導的細胞死亡影響很小，而Nec?1可以顯著降低細胞死亡，胰蛋白酶抑制劑與Nec?1的組合對細胞死亡具有更顯著抑制作用［17］。RIP3激酶活性抑制劑或MLKL功能抑制劑都可以保護原代KC免受硝普鈉誘導的死亡［18］。在HaCaT細胞、原代KC中，敲低RIP1或RIP3都可抑制硝普鈉誘導的細胞死亡，而RIP3缺陷型動物中RIP1正常表達，未能檢測到磷酸化MLKL［19?20］，說明在KC程序性壞死中RIP3位于RIP1下游，MLKL位于RIP3下游。

目前發(fā)現，程序性壞死參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，在炎癥性皮膚病中具有重要作用。炎癥性皮膚病是一組復雜的、免疫介導的非傳染性皮膚疾?。?1］。Bonnet等［20］發(fā)現，FADD特異性敲除的小鼠發(fā)生RIP3依賴性程序性壞死和炎癥性皮膚損傷，caspase?8特異性敲除小鼠也發(fā)展為炎癥性皮膚損傷，而在這些小鼠中進一步敲除RIP3可以預防皮損［22］，說明KC程序性壞死在炎癥性皮膚病中具有關鍵作用。研究發(fā)現，在炎癥性皮膚病如扁平苔蘚、紅斑狼瘡等中可檢測到界面皮炎，其基本特征為免疫細胞浸潤表皮基底膜且細胞膨脹、KC大量凋亡［23］。Lauffer等［24］發(fā)現，用扁平苔蘚和紅斑狼瘡皮損部位T細胞上清液（T?cell supernatant，TCS）刺激KC，RIP3和磷酸化MLKL表達皆上調；用除去了IFN?γ和TNF?α的TCS刺激KC，未檢測到RIP3和磷酸化MLKL活化；用僅除去IFN?γ的TCS和僅除去TNF?α的TCS分別刺激KC，均可見RIP3和磷酸化MLKL表達增加。由此可見界面皮炎發(fā)病機制中，除細胞凋亡之外，KC程序性壞死也發(fā)揮著重要作用，可能通過IFN?γ和TNF?α激活RIP3、磷酸化MLKL等，引起KC死亡，但仍需進一步研究。

中毒性表皮壞死松解癥（TEN）以KC廣泛性壞死為特征。目前認為，藥物在特殊的遺傳背景下激活T細胞克隆增殖，遷移至皮膚，通過直接的細胞毒作用或釋放凋亡相關的細胞因子放大炎癥反應，最終導致KC大量死亡［25］，死亡過程包括細胞凋亡和壞死。Saito等［26］首次用電鏡發(fā)現，在TEN中KC發(fā)生的壞死是程序性壞死，小鼠實驗中通過抑制程序性壞死可以完全阻斷TEN樣病變。Kim等［17］發(fā)現，TEN患者皮膚切片中RIP3高表達，磷酸化MLKL升高，提示可能通過RIP3表達上調，與RIP1結合后，產生ROS，激活MLKL等下游因子，引起KC程序性壞死［27］，而RIP3高表達可以引起KC對壞死刺激高敏、ROS產生、c?Jun氨基末端激酶（JNK）通路激活，從而加重病理過程［25］。

凋亡相關蛋白在皮膚穩(wěn)態(tài)中有重要作用，可與caspase?8聚合形成異源二聚體，此時caspase?8不能啟動凋亡，而是通過對RIP1 Asp324位點和RIP3 Asp328位點的切割［7］，防止RIP1/RIP3復合物形成來抑制程序性壞死［19］。在TEN/Stevens?Johnson綜合征（SJS）患者的皮損中，凋亡相關蛋白的表皮表達顯著降低，而在健康皮膚基底層高表達，由此推測凋亡相關蛋白缺失可能是TEN/SJS患者細胞大量死亡的先決條件［26，28］。由此引起的皮膚炎癥可以通過中和TNF來緩解，目前TNF?α拮抗劑如英夫利西單抗已被用于TEN的治療，在一些病例中顯示較好療效［27，29］。最新臨床試驗也表明，TNF?α拮抗劑依那西普改善了SJS?TEN患者的預后［30］。

三、展望

KC的程序性壞死已在TEN中被發(fā)現，提示曾經被認為是無法控制的細胞壞死有可能被調控。雖還未明確程序性壞死是否為TEN的罪魁禍首或繼發(fā)于TEN的病理生理表現，RIP1激酶活性的抑制通常會減緩或阻止疾病進展，因此也可考慮將其應用于阻斷KC大量壞死，減輕疾病嚴重程度［31］。此外，在小鼠模型中已發(fā)現，KC的程序性壞死對表皮的自穩(wěn)有重要作用，界面皮炎發(fā)病機制的研究已證實KC程序性壞死的作用，因此在炎癥性皮膚病如特應性皮炎、銀屑病中，KC的程序性壞死可能是又一研究靶點。