姚 剛 朱博馳 于挺敏 滿玉紅

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

丁苯酞(NBP)是人工合成的消旋正丁基苯酞，是治療缺血性腦卒中的國(guó)家級(jí)一類新藥，能夠明顯減輕急性缺血性腦卒中患者中樞神經(jīng)功能缺損〔1〕。目前發(fā)現(xiàn)NBP對(duì)血管性癡呆(VD)也有較明顯的改善作用〔2，3〕，但其作用機(jī)制還缺乏深入的研究。腦血管病后慢性腦缺血是VD最常見(jiàn)的病因，其病理機(jī)制與腦缺血引發(fā)的認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、興奮性氨基酸、炎性因子、膽堿能通道功能受損等多種因素有關(guān)，其中細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)是人們研究的熱點(diǎn)〔4，5〕。B淋巴細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2家族，通過(guò)線粒體相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔6〕，其中以Bax基因?yàn)榇淼拇俚蛲龌蚺c以Bcl-2基因?yàn)榇淼目沟蛲龌蛳嗷マ卓梗瑢?shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。本研究通過(guò)觀察NBP對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)Bax和Bcl-2表達(dá)的影響，探討NBP對(duì)VD大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 80只健康SPF級(jí)Wistar大鼠(雌雄各半)，體重200～220 g，購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20100041)。大鼠抗Bcl-2多克隆抗體、抗Bax多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物公司。

1.2分組 大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度22℃～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，光暗周期12 h，自由攝取食物和水，動(dòng)物模型制備前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。按隨機(jī)分組法分為VD組、NBP治療組、NBP對(duì)照組、Sham組，每組20只，每組又分為4個(gè)亞組：術(shù)后1、2、4、8 w，每個(gè)亞組5只。

1.3動(dòng)物模型制備 采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型。VD組和NBP治療組大鼠術(shù)前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺(tái)，常規(guī)消毒頸部手術(shù)區(qū)域，頸前正中作一長(zhǎng)約1 cm的縱形切口，鈍性逐層分離皮下軟組織、頸前肌群，分離出氣管側(cè)后方的頸動(dòng)脈鞘，進(jìn)而分離頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)，以1號(hào)絲線永久結(jié)扎頸總動(dòng)脈，同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈。局部消毒后恢復(fù)組織層次并縫合皮膚。Sham組和NBP對(duì)照組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余操作與VD組和NBP治療組大鼠一致。術(shù)后動(dòng)物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。

1.4藥物干預(yù) NBP對(duì)照組和NBP治療組大鼠清醒后(術(shù)后1 d，可在籠中自由活動(dòng))，給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg·kg-1·d-1(藥物劑量根據(jù)成人常規(guī)每日劑量進(jìn)行換算)，Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射(0.2 ml/d)。各組大鼠連續(xù)腹腔注射給藥7 d。

1.5標(biāo)本采集及免疫組化 各組大鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、8 w)，給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉劑量0.3 ml/100 g)，生理鹽水心臟灌注5 min，斷頭取腦，分離出海馬，將組織塊迅速置入10%中性甲醛固定48 h，PBS洗脫3次，80%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片。免疫組化方法采用SP法。

1.6顯微圖像采集及分析 每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性表達(dá)灰度值，同時(shí)計(jì)算每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)占所有細(xì)胞總數(shù)的比率，細(xì)胞表達(dá)平均灰度計(jì)算采用視野灰度×陽(yáng)性細(xì)胞比率，以5個(gè)視野的平均值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件包組間差別采用單因素方差分析和Tukey比較。

2 結(jié) 果

2.1Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá) Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。VD組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目較少，排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，Bax表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，主要位于神經(jīng)元。NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷明顯減小，Bax表達(dá)顯著減弱。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 1 w、2 w Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)(DAB，×400)

VD組和NBP治療組大鼠1 w、2 w、4 w和8 w時(shí)海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達(dá)灰度明顯高于Sham組(P<0.05)；NBP治療組大鼠4 w和8 w時(shí)海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達(dá)均明顯低于VD組大鼠相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。VD組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)CA1 區(qū)Bax表達(dá)灰度比較，8 w組明顯高于1 w和2 w組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá) Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。VD組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū) Bcl-2表達(dá)顯著增加，NBP對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)最強(qiáng)，NBP對(duì)照組和Sham組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)完好，神經(jīng)細(xì)胞分布正常，Bcl-2表達(dá)中等程度或低表達(dá)。見(jiàn)圖3，圖4。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bax表達(dá)灰度比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與VD組比較：2)P<0.05；與同組8 w比較；3)P<0.01；下表同

圖3 1 w、2 w Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)(DAB，×400)

圖4 4 w、8 w Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)(DAB，×400)

各時(shí)間點(diǎn)，NBP對(duì)照組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達(dá)灰度均明顯高于Sham組(P<0.05)；2 w、4 w和8 w時(shí)NBP對(duì)照組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達(dá)灰度均明顯高于VD組(P<0.05)；8 w時(shí)NBP治療組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達(dá)灰度明顯高于VD組(P<0.05)。各組大鼠海馬CA1 區(qū)Bcl-2表達(dá)灰度在不同時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)灰度比較

3 討 論

永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型是目前公認(rèn)的VD造模方法，大鼠腦血管系統(tǒng)與人類一樣，具有發(fā)達(dá)的腦動(dòng)脈環(huán)(Willis環(huán))，當(dāng)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，并不會(huì)造成前腦組織的血供完全阻斷，而是處于缺血狀態(tài)〔7〕，接近VD慢性腦灌注不足的發(fā)病機(jī)制。海馬、額葉等腦區(qū)的缺血性損傷是發(fā)生VD的基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，瀕死狀態(tài)的神經(jīng)元中Bax呈高度表達(dá)〔8〕，Bax過(guò)度表達(dá)可以拮抗Bcl-2抑制凋亡作用，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，前腦缺血可以導(dǎo)致海馬CA1區(qū)誘導(dǎo)凋亡的Bax蛋白表達(dá)增加，Bax蛋白表達(dá)高峰先于DNA碎裂高峰，因而認(rèn)為，Bax蛋白過(guò)度表達(dá)引起了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DNA斷裂和凋亡〔9〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NBP能夠?qū)η澳X缺血導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)Bax蛋白過(guò)度表達(dá)起到抑制作用。

Bcl-2與Bax具有高度同源的氨基酸序列，其抗凋亡作用受到Bax的拮抗，Bcl-2/Bax的比值對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵的作用〔10〕。Bcl-2在線粒體水平對(duì)抗各種凋亡刺激，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，其抗凋亡機(jī)制包括抑制Ca2+超載、抑制氧自由基、控制凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑、抗谷氨酸毒性等多個(gè)方面〔11〕。Manji等〔12〕認(rèn)為提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)Bcl-2的表達(dá)水平，能夠提高神經(jīng)元承受損傷的能力，還可以促進(jìn)神經(jīng)軸突的再生。本研究發(fā)現(xiàn)，NBP對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)最強(qiáng)，VD組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)有下降趨勢(shì)，但未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8 w時(shí)，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2表達(dá)顯著增加，提示NBP可以提高大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)在制備VD大鼠的基礎(chǔ)上，應(yīng)用NBP給予干預(yù)治療，觀察不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)凋亡調(diào)控基因Bcl-2家族中促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl-2表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：VD大鼠海馬CA1區(qū)促凋亡蛋白Bax過(guò)度表達(dá)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有減弱趨勢(shì)；NBP對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用，可以抑制缺血損傷導(dǎo)致的海馬CA1區(qū)Bax蛋白過(guò)度表達(dá)，同時(shí)能夠提高大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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