, , , , , 明葉

(1. 迪沙藥業(yè)集團國家認定企業(yè)技術(shù)中心, 威海 264200; 2. 煙臺萬潤藥業(yè)有限公司, 煙臺 264000)

普瑞巴林是一種新型抗癲癇藥,它的化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有γ-氨基丁酸,具有抗痙攣作用,由輝瑞公司研發(fā),用于治療外周神經(jīng)痛,或輔助治療部分性癲癇發(fā)作。2008年12月,美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)普瑞巴林(商品名“樂瑞卡”)用于治療糖尿病性外周神經(jīng)痛(DPN)和皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)這兩種最常見的神經(jīng)性疼痛[1-3]。

普瑞巴林化學(xué)名為(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸,該化合物結(jié)構(gòu)中有1個手性中心,存在一個光學(xué)異構(gòu)體,即普瑞巴林R-對映異構(gòu)體。普瑞巴林及普瑞巴林R-對映異構(gòu)體對該藥物的作用受體具有不同的親和力,表現(xiàn)出不同的藥代動力學(xué)特征和藥理作用,其中普瑞巴林為藥物有效成分[4-5]。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局藥物審評中心頒布的《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[6]中要求,普瑞巴林R-對映異構(gòu)體作為普瑞巴林的雜質(zhì)進行研究控制。隨著色譜分離檢測技術(shù)的發(fā)展,氣相色譜法、液相色譜法及毛細管電泳色譜法等均已應(yīng)用到光學(xué)異構(gòu)體的檢測,特別是手性固定相高效液相色譜法已廣泛應(yīng)用到光學(xué)異構(gòu)體的檢測[7-12]。由于普瑞巴林的紫外響應(yīng)低,檢測靈敏度差,故開發(fā)了反相高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測法用于檢測普瑞巴林R-對映異構(gòu)體。

已報道有兩種手性高效液相色譜法測定普瑞巴林中光學(xué)異構(gòu)體的含量,一種方法是以Chiralcel OD-H手性柱為分離柱,流動相為正己烷-異丙醇-三氟乙酸(965+32+3)混合液,采用蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)[13];另一種方法以柱前衍生化高效液相色譜法測定普瑞巴林中的光學(xué)異構(gòu)體[14-15],采用Na-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺(FDNPAA)作為柱前衍生化試劑,該試劑與普瑞巴林的物質(zhì)的量之比在2.96以上可定量反應(yīng),生成的化合物可用普通色譜柱分離以紫外檢測器測定。

第一種方法運用正相色譜,正相色譜的酸堿調(diào)節(jié)劑比較單一,對方法開發(fā)存在局限性,且所用溶劑揮發(fā)性強,極不環(huán)保;且很多藥品為水溶性藥物,在異丙醇中溶解性不好,這樣的供試品溶液進入體系后極易堵塞色譜柱,同時由于進入正相體系后分散程度不好導(dǎo)致峰形變差;第二種方法為衍生化法,操作復(fù)雜,且衍生化程度受每次衍生化反應(yīng)限制。

鑒于以上原因,本工作開發(fā)反相兩性手性色譜柱串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測器法用于測定普瑞巴林原料藥中普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的含量,采用甲醇、水等經(jīng)濟易得、環(huán)保實用的常用溶劑,用緩沖溶液調(diào)節(jié)酸度以實現(xiàn)最佳分離。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配Aglient色譜工作站和ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器;DL-1000D型智能超聲儀。

對照品儲備溶液:稱取普瑞巴林R-對映異構(gòu)體適量,加水溶解后配成質(zhì)量濃度約30.0 mg·L-1的溶液。使用時用水稀釋成所需質(zhì)量濃度。

甲醇、乙腈為色譜純;二乙胺、甲酸為分析純;消旋體(普瑞巴林與普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的物質(zhì)的量比為1∶1)純度不小于99.0%;普瑞巴林R-對映異構(gòu)體純度不小于99.0%。

1．2 色譜條件

CHIRALPAK ZWIX(+)手性色譜柱(4.0 mm×150 mm,3 μm);以甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5)為流動相,流量為0.5 mL·min-1;柱溫為25 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度為70 ℃,載氣流量為2.0 L·min-1。

1．3 試驗方法

1．3．1 方法開發(fā)溶液

稱取消旋體適量,加水溶解后配成各異構(gòu)體質(zhì)量濃度約為2 g·L-1的溶液,作為方法開發(fā)溶液。

1．3．2 系統(tǒng)適用性溶液

稱取普瑞巴林與普瑞巴林R-對映異構(gòu)體對照品各適量,用流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含普瑞巴林2.0 mg,普瑞巴林R-對映異構(gòu)體3.0 μg的混合溶液,作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。

1．3．3 供試品溶液

稱取樣品適量,用水溶解并適當(dāng)稀釋,作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件優(yōu)化

2．1．1 流動相體系

分別選用甲醇-水(900+100)、甲醇-水-甲酸(900+100+2.0)、甲醇-水-甲酸-二乙胺(900+100+2.0+2.5)、甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(700+200+100+2.0+2.5)、甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5)等5種流動相體系,在儀器工作條件下進樣方法開發(fā)溶液,所得色譜圖見圖1。

由圖1可知:以甲醇-水(900+100)為流動相,異構(gòu)體與普瑞巴林色譜峰拖尾,峰展寬較大,峰形差,分離度差;以甲醇-水-甲酸(900+100+2.0)為流動相,異構(gòu)體與普瑞巴林色譜峰的峰形得到改善,但兩峰重合;以甲醇-水-甲酸-二乙胺(900+100+2.0+2.5)為流動相,異構(gòu)體與普瑞巴林色譜峰的峰形佳,不拖尾,但不能達到基線分離;以甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(700+200+100+2.0+2.5)為流動相,異構(gòu)體與普瑞巴林色譜峰的峰形佳,不拖尾,仍不能達到基線分離;以甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5)為流動相,異構(gòu)體與普瑞巴林之間色譜峰的分離度好,峰形尖銳,分析周期合理。因此,試驗選擇甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5)作為流動相體系。

(a) 甲醇-水(900+100) (b) 甲醇-水-甲酸(900+100+2.0) (c) 甲醇-水-甲酸-二乙胺(900+100+2.0+2.5)

(d) 甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(700+200+100+2.0+2.5) (e) 甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5) 1-普瑞巴林R-對映異構(gòu)體;2-普瑞巴林圖1 不同流動相條件下的色譜圖Fig. 1 Chromatograms with different mobile phases

2．1．2 柱溫

以甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5)為流動相,在儀器工作條件下分別在25,30,40 ℃的柱溫下進樣方法開發(fā)溶液。結(jié)果表明:隨著柱溫的升高,異構(gòu)體與普瑞巴林之間分離度無明顯變化,25 ℃較30 ℃和40 ℃更利于色譜柱使用壽命的延長,因此試驗選擇柱溫為25 ℃。

2．2 蒸發(fā)光散射檢測器條件的選擇

試驗對ELSD的漂移管溫度及載氣的流量進行了考察。當(dāng)用乙腈(1 mL·min-1)為溶劑時,對應(yīng)漂移管溫度為70 ℃,氣體流量為1.7 L·min-1;當(dāng)用甲醇(1 mL·min-1)為溶劑時,對應(yīng)漂移管溫度為60 ℃,氣體流量為1.6 L·min-1;當(dāng)用水(1 mL·min-1)為溶劑時,對應(yīng)漂移管溫度為115 ℃,氣體流量為3.2 L·min-1。根據(jù)ELSD使用手冊,按流動相中混合溶劑的比率,計算混合流動相所需的初始溫度和氣體流量。對于甲醇-乙腈-水-甲酸-二乙胺(450+450+100+2.0+2.5)流動相體系,計算得初始溫度為70 ℃,氣體流量為1.8 L·min-1。

2．2．1 漂移管溫度

試驗考察了漂移管溫度為60,70,80 ℃時對測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在較低溫度下噪聲稍大,基線不穩(wěn);當(dāng)溫度為70,80 ℃時,噪聲較小,基線較平穩(wěn)。由于較高的溫度對被測樣品的穩(wěn)定性會有影響,試驗選擇70 ℃作為漂移管溫度。

2．2．2 載氣流量

試驗考察了載氣流量分別為1.6,2.0,2.5 L·min-1時對測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):載氣流量越小,檢測靈敏度越低;隨著流量增大,檢測靈敏度升高,但是到達2.5 L·min-1以后,載氣流量的升高對檢測靈敏度無影響。綜合考慮,試驗選擇載氣流量為2.0 L·min-1。

2．3 分析方法驗證

2．3．1 專屬性

在儀器工作條件下進樣系統(tǒng)適用性溶液,色譜圖見圖2。

1-普瑞巴林R-對映異構(gòu)體;2-普瑞巴林圖2 系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the system suitability solution

由圖2可知:普瑞巴林R-對映異構(gòu)體和普瑞巴林能有效分離(分離度均大于2.0),空白溶劑峰不干擾測定。說明色譜條件專屬性較好。

2．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

移取對照品儲備溶液適量,逐步稀釋配制成6份溶液,在儀器工作條件下進樣分析,記錄色譜圖。以峰面積y對質(zhì)量濃度x作回歸處理,結(jié)果表明:普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的質(zhì)量濃度在0.80～4.5 mg·L-1內(nèi)呈線性,線性回歸方程為y=0.189 4x-0.058 1,相關(guān)系數(shù)為0.995 3。

取對照品溶液,用水逐步定量稀釋,在儀器工作條件下進樣分析,當(dāng)信噪比(S/N)為3～5時,普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的質(zhì)量濃度為0.30 mg·L-1;當(dāng)信噪比(S/N)為10時,普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的質(zhì)量濃度為0.80 mg·L-1。因此,檢出限和測定下限分別為0.30,0.80 mg·L-1。

2．3．3 精密度

按照1.3.2節(jié)中系統(tǒng)適用性溶液配制方法,制備6份系統(tǒng)適用性溶液,在儀器工作條件下進樣分析,測定普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的含量,計算得6次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%,說明方法的重復(fù)性良好。

按照1.3.2節(jié)中系統(tǒng)適用性溶液配制方法,制備6份系統(tǒng)適用性溶液,由不同試驗人員在不同試驗日期在儀器工作條件下進樣分析,測定普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的含量,計算得RSD為2.4%,說明方法的精密度較高。

2．3．4 回收試驗

稱取普瑞巴林樣品約20 mg至10 mL容量瓶中,分別加入30.0 mg·L-1普瑞巴林R-對映異構(gòu)體儲備溶液0.80 mL,用水溶解后定容,搖勻,即為加標(biāo)80%溶液,平行配制3份。同法配制加標(biāo)100%、加標(biāo)120%溶液。在儀器工作條件下進樣分析,計算得加標(biāo)回收率在93.8%～94.5%之間,能夠滿足普瑞巴林原料藥中普瑞巴林R-對映異構(gòu)體檢測的需要。

2．3．5 溶液穩(wěn)定性

配制系統(tǒng)適用性溶液,分別在0,1,2,4,8,24 h后進行測定,結(jié)果表明:室溫條件下放置24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定,6次測定結(jié)果的RSD為2.2%。

2．4 樣品分析

采用建立的方法測定4批普瑞巴林原料藥中普瑞巴林R-對映異構(gòu)體的含量,均未檢出普瑞巴林R-對映異構(gòu)體。

本工作建立了測定普瑞巴林原料藥中普瑞巴林R-對映異構(gòu)體含量的兩性反相高效液相色譜法,與已有的方法相比,該方法快速、有效、靈敏,能夠滿足生產(chǎn)中對普瑞巴林原料藥中普瑞巴林R-對映異構(gòu)體含量測定的要求。

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