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(1. 上海市計量測試技術研究院, 上海 201203; 2. 上海師范大學 生命與環(huán)境科學學院, 上海 200234)

四季三黃丸由大黃、黃柏、黃芩和梔子共4味藥制成,臨床上用于口鼻生瘡、咽疼齒痛、口干舌燥、目眩頭暈、大便秘結(jié)、小便赤黃等癥狀[1],其中大黃具有瀉熱毒、破積滯、行瘀血等功效,主要活性成分為大黃素、大黃酸、大黃酚等物質(zhì)[2];黃柏具有清熱、燥濕、瀉火、解毒等功效,主要活性成分為小檗堿、巴馬汀、黃柏堿等[3];黃芩具有清熱瀉火、燥濕解毒功效,主要活性成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等[4];梔子清熱、瀉火、涼血,主要成分為梔子苷[5]。目前,四季三黃丸收載于為《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第二冊,該標準僅在檢查項下規(guī)定了該藥物應符合丸劑項下有關的各項規(guī)定,對其有效成分含量或質(zhì)量控制方面并未做具體規(guī)定[1]。目前公開報道的四季三黃丸藥物中有效成分的質(zhì)量控制方法主要為薄層色譜法和液相色譜法[6-8],對其中一種成分(如大黃酚)或兩種成分(如黃芩苷、鹽酸小檗堿)進行定性或定量研究[9-16],但同時測定四季三黃丸中4種活性成分含量的方法尚未見報道。本工作以梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和大黃素等4種活性成分作為四季三黃片的質(zhì)控指標,應用高效液相色譜法(HPLC)對這4種活性成分進行含量測定。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器(DAD);Mettler-Toledo MX 5型百萬分之一電子分析天平;SK 8210LHC型超聲波清洗器。

混合對照品儲備溶液:稱取梔子苷7.662 mg、鹽酸小檗堿8.996 mg、黃芩苷3.871 mg、大黃素4.458 mg置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度分別為766.2,899.6,387.1,445.8 mg·L-1的梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和大黃素混合對照品溶液。

大黃素標準品(純度不小于98%)、梔子苷標準品(純度不小于98%)、黃芩苷標準品(純度不小于98%),鹽酸小檗堿純度(按含C20H18ClNO4計) 86.7%;乙腈為色譜純。

1．2 儀器工作條件

Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為乙腈,B為0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸溶液;流量為1.0 mL·min-1;進樣量為5 μL。梯度洗脫程序:0～5 min時,A為15%;5～10 min時,A由15%升至21%;10～12 min時,A由21%升至30%;12～24 min時,A由30%升至32%;24～28 min時,A由32%升至55%;28～48 min時,A由55%升至80%。梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素的檢測波長分別為240,345,278,287 nm。在此條件下梔子苷、小檗堿、黃芩苷、大黃素的保留時間分別為8.76,17.38,18.63,38.17 min。

1．3 試驗方法

取四季三黃丸1袋,研磨至細粉,取細粉約0.1 g,精密稱定后置具塞錐形瓶中,加入甲醇20 mL,稱定質(zhì)量,于40 ℃超聲30 min取出,放冷,稱質(zhì)量,加甲醇補足減失質(zhì)量,過濾,取續(xù)濾液作為樣品溶液。根據(jù)四季三黃丸中藥物處方比例及工藝,再按樣品溶液的制備方法,分別配制梔子苷陰性對照溶液、鹽酸小檗堿陰性對照溶液、黃芩苷陰性對照溶液和大黃素陰性對照溶液。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為及專屬性試驗

取混合對照品溶液、樣品溶液和4種陰性對照溶液,分別進樣,記錄色譜圖(見圖1～圖4)。結(jié)果顯示,樣品中的輔料及其他成分均不干擾目標物的測定。

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)和梔子苷陰性樣品(C) 在240 nm處的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the mixed reference substance (A), the sample (B) and the negative sample without geniposide (C) at 240 nm

圖2 混合對照品(A)、樣品(B)和鹽酸小檗堿陰性樣品(C) 在345 nm處的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the mixed reference substance (A), the sample (B) and the negative sample without berberine hydrochloride (C) at 345 nm

圖3 混合對照品(A)、樣品(B)和黃芩苷陰性樣品(C) 在278 nm處的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the mixed reference substance (A), the sample (B) and the negative sample without baicalin (C) at 278 nm

圖4 混合對照品(A)、樣品(B)和大黃素陰性樣品(C) 在287 nm處的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the mixed reference substance (A), the sample (B) and the negative sample without emodin (C) at 287 nm

2．2 色譜條件的選擇

2．2．1 色譜柱

試驗考察了Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和ZORBAX Rx-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在相同的流動相條件下前者的分離效果較好。因此,試驗選擇Phenomenex Luna C18色譜柱作為分離色譜柱。

2．2．2 流動相

根據(jù)待測成分的理化特征和色譜行為,試驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液等流動相體系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脫待測成分時,鹽酸小檗堿和黃芩苷分離度較好,基線較低,因此試驗選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

2．2．3 檢測波長

采用DAD進行全波長掃描(190～400 nm),分析4種活性成分的紫外吸收光譜,得到這4種化合物的最大吸收波長,最終確定梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素的檢測波長分別為240,345,278,287 nm。在樣品檢測過程中,同時記錄4個波長的色譜圖。

2．3 提取溶劑的選擇

先后采用加熱回流法、索氏提取法、超聲提取法對四季三黃丸中梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和大黃素等4種化合物進行提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取效率高且操作簡便;提取溶劑考察了甲醇(3+7)溶液、甲醇(1+1)溶液、甲醇、乙醇,結(jié)果表明甲醇的綜合提取效率最高。

2．4 標準曲線與檢出限

分別移取混合對照品儲備溶液0.10,0.20,0.30,0.60,0.80,1.00 mL置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,制成系列質(zhì)量濃度的溶液,在儀器工作條件下進行測定,記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標進行線性回歸,線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比計算檢出限,結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)與檢出限Tab. 1 Linearity parameters and detection limits

2．5 重復性和穩(wěn)定性試驗

取同一批四季三黃丸6份,按試驗方法制備進行平行測定,記錄待測成分的峰面積,計算出梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為1.9%,2.6%,3.1%,1.4%,表明方法的重復性良好。

取同一樣品溶液每隔2小時進樣1次,連續(xù)進樣6次,記錄待測成分的峰面積,計算得梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素峰面積的RSD分別為3.3%,4.9%,4.6%,4.4%,表明樣品溶液的穩(wěn)定性良好。

2．6 精密度與回收試驗

取已知含量的同一批樣品,各加入梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷、大黃素對照品適量,制備高、中、低等3種濃度水平的加標樣品,按試驗方法測定4種成分的含量,平行測定6次,計算回收率和RSD,結(jié)果見表2。

表2 精密度與回收試驗結(jié)果(n=6)Tab. 2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

2．7 樣品分析

取3批四季三黃丸樣品,按試驗方法制備樣品溶液,在儀器工作條件下進樣測定,四季三黃丸中梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和大黃素含量的測定結(jié)果見表3。

本工作采用高效液相色譜法測定四季三黃丸中4種活性成分,在同一色譜條件下同時測定梔子苷、鹽酸小檗堿、黃芩苷和大黃素的含量。該方法與傳統(tǒng)方法相比,可以更加全面地評價四季三黃丸的質(zhì)量。該方法簡單、快速,并具有較高的準確度和精密度,可以滿足檢測工作的需要。

表3 樣品中4種活性成分含量的測定結(jié)果Tab. 3 Determination results of the 4 effective components in samples mg·kg-1

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