馬 昭，連科訊，劉 鋼，劉曉婷，喬嚴(yán)杰，朱曉慶，谷新利

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)藥物，它資源豐富、歷史悠久，與西藥相比具有毒副作用小，低殘留，不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)，是醫(yī)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著中藥藥理學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)的相互滲透，人們對(duì)中藥與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用的研究愈加深入，發(fā)現(xiàn)中草藥中的多種提取物可以參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。中藥多糖是一種從中草藥中提取出的具有提高機(jī)體免疫力，抗病毒，抗氧化等多種作用的生物活性物質(zhì)之一，它能夠通過(guò)激活T、B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞因子的生成，激活補(bǔ)體系統(tǒng)等方式調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。并且中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用受劑量的影響，即中藥多糖的免疫增強(qiáng)作用有其最適劑量[1-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)胞表面存在著與免疫排斥有關(guān)的組織抗原，稱為組織相容性抗原(histocompatibility antigen),而編碼組織相容性抗原的是具有高度多態(tài)性的基因群，稱為主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)。MHC編碼的蛋白與免疫識(shí)別、免疫應(yīng)答有關(guān)，因此MHC在某種程度上決定動(dòng)物個(gè)體對(duì)疾病的易感性，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起著非常重要的作用。Shanaz等[4]應(yīng)用PCR-SSCP方法對(duì)Bantam、BWLH和WLH 3個(gè)雞種的MHCB-LβII多態(tài)性與免疫應(yīng)答相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)B-Lβ II基因的等位基因B15和B19單倍體雞ND和SRBC抗體滴度均顯著高于其他單倍體，是優(yōu)勢(shì)基因型。朱曉慶等[5]研究發(fā)現(xiàn)，一定純度中藥復(fù)方多糖的免疫調(diào)節(jié)劑量的篩選會(huì)受MHCB-LβII基因Hin1I位點(diǎn)多態(tài)性的影響，且一定純度中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHCB-LβII基因型雞的最適免疫調(diào)節(jié)劑量不同?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】MHC II類分子不僅被CD4 T細(xì)胞識(shí)別，是CD4 T識(shí)別的靶分子，而且參與外源性抗原呈遞、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)。不同個(gè)體間由于MHC II基因多態(tài)性使得MHC II 類分子接納與提呈抗原具有一定的選擇性，導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)同一抗原表現(xiàn)出免疫應(yīng)答強(qiáng)弱的差異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】試驗(yàn)從細(xì)胞分子水平擬排除MHCB-LβII多態(tài)性而導(dǎo)致的不同基因型機(jī)體免疫應(yīng)答能力不同的影響，篩選出能顯著增強(qiáng)與雞免疫功能相關(guān)的各MHCB-LβII基因型雞免疫的中藥復(fù)方多糖的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物

中藥復(fù)方多糖由黨參、山楂、熟地、何首烏、當(dāng)歸、茯苓、補(bǔ)骨脂等11味中藥組成，各單味藥均購(gòu)自石河子市醫(yī)藥公司；中藥復(fù)方多糖粗提取物是從中藥復(fù)方中采用水提-醇沉法提取，再經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得精制的中藥復(fù)方多糖，即cCHMPS，其純度為77.10%；用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器

雞外周血淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品)；RPMI 1640培養(yǎng)基，PBS磷酸緩沖液，胎牛血清，SYBR Green熒光染料，RT-PCR試劑(北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)；DEPC(上海生物工程公司產(chǎn)品)；雞新城疫疫苗(La Sota株，普萊柯生物工程股份有限公司產(chǎn)品)；TaqDNA聚合酶，RNA、DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it(北京田根生物工程有限公司產(chǎn)品)；高速冷凍離心機(jī)，垂直離心機(jī)。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

500羽1日齡京紅1號(hào)蛋雞，購(gòu)自新疆昌吉某一孵化場(chǎng)。翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20℃冷凍保存。按DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明書提取雞全血DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，應(yīng)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：上游引物：5’-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5’-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，擴(kuò)增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系為20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，7μL ddH2O，總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸35 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.4 淋巴細(xì)胞的分離與成活率檢測(cè)

根據(jù)PCR-SSCP基因型分型結(jié)果將雞進(jìn)行分組，然后靜脈采集血液參照文獻(xiàn)謝昆等[6]提取淋巴細(xì)胞，用胎盤藍(lán)染色，在顯微鏡下數(shù)出死細(xì)胞和活細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算活細(xì)胞的成活率。

1.2.5 試驗(yàn)分組與細(xì)胞培養(yǎng)

用含20%的胎牛血清的培養(yǎng)液將分離得到的淋巴細(xì)胞調(diào)整為5×106個(gè)/mL。試驗(yàn)按不同基因型分組，每組設(shè)3個(gè)劑量組，每個(gè)培養(yǎng)皿加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入不同濃度的cCHMPS，使終濃度分別達(dá)到100、75、50、0 μg/mL。將培養(yǎng)皿置于37℃、5%的CO2的恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.6 雞淋巴細(xì)胞總RNA提取

收集淋巴細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取淋巴細(xì)胞的總RNA。RNA純度檢測(cè)：檢測(cè)其D260 nm/D280 nm比值，其比值在1.8～2.0。

1.2.7 RNA反轉(zhuǎn)錄

將2 μL 5×gDNA Graser Buffer、1 μL gDNA Eraser、5 μL RNase Free Water、2 μL RNA模板混勻，42℃反應(yīng)2 min，迅速冰浴，即反應(yīng)液Ⅰ，最后將1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase Free Water加入反應(yīng)液Ⅰ中，37℃反應(yīng)15 min，85℃加熱5 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，取出EP管，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 cDNA的PCR反應(yīng)體系與程序

IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin基因的引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)GenBank報(bào)道的IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin基因mRNA的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)RCR特異性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列及PCR條件
Table 1 Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

目的基因Targetgene登錄號(hào)GenBankNo產(chǎn)物Products引物序列(5′→3)Sequenceofprimer(5′→3)退火溫度AnnealingtemperatureIL-2GU＿119890．1188bpF：CACACCAACTGAGACCTGR：TCTTGCATTCACTTCCGGTGT58℃IL-4GU＿119892．1382bpF：AACATGCGTCAGCTCCTGAAR：CCATTGAAGTAGTGTTGCCTGCT60℃IL-12NM＿213571．1133bpF：GAGTGGAACGATGAGACACCAGR：CCTTCACTTCGGTGGTCAGAG58℃β-ActinNM＿205518．1100bpF：ACCGCAAATGCTTCTAAACCR：ATAAAGCCATGCCAATCTCG59℃

cDNA的PCR反應(yīng)體系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O，10 μL 的2×RCRMix，總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMIX 10 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 uL ddH2O，20 μL體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s；退火15 s，72℃延伸10 s，共42個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 2 -△△ Ct法計(jì)算目的基因IL-2、IL-4、IL-12 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±SD)表示。用 SPSS 17.0 軟件分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果以P<0.05 作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，并且將對(duì)照組的mRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)置為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 MHC B-LβII基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，取所得PCR產(chǎn)物5 μL于的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果為，所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增結(jié)果較好，片段長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致，條帶清晰，無(wú)非特異性條帶，可直接進(jìn)行SSCP分析。圖1

1：DNA Maker I， 2-11：MHC B-LβII基因(MHC B-LβII Gene)

圖1 MHC B-LβII基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-L II gene

2.2 PCR-SSCP

對(duì)所有DNA樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。圖2

注：1、6、8、10、12：BC基因型；3、5：AA基因型；2、4、7、9、11、13：BB基因型

Note: 1、6、8、10、12：BC genotype； 3、5：AA genotype； 2、4、7、9、11、13：BB genotype

圖2 部分雞MHC B-LβII基因PCR-SSCP電泳圖譜
Fig.2 Electrophoretic patterns of the PCR-SSCP product of MHC B-LβII gene

2.3 IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin擴(kuò)增結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的雞IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin 基因的引物，以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別獲得了188、382和133 bp的目的條帶。圖3

2.4 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβII基因型雞外周血淋巴細(xì)胞中IL-2 mRNA表達(dá)量

研究表明，與對(duì)照組相比，cCHMPS能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA的表達(dá)，且在不同基因型雞中，最有效提高IL-2 mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75、50 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時(shí)雞淋巴細(xì)胞 IL-2 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時(shí)，IL-2 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。表2

1: IL-12基因(IL-12 gene)；2：IL-4基因(IL-4 gene)；3：IL-2基因(IL-2 gene)；4：內(nèi)參(β-Actin gene)；5：Maker

圖3 IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin凝膠電泳圖
Fig.3 Electrophoretic patterns of the PCR product of IL-2、IL-4、IL-12 and β-Actingene表2 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)
Table 2 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-2 mRNA expression level

基因型Genotype不同劑量的中藥復(fù)方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1189±001a?182±002a?166±002b?BB基因型 BBGenotype1167±004a?163±005a?181±002b?BC基因型 BCGenotype1176±006a?164±005b?165±003b?

注：同行肩注小寫的字母表示同一基因型組不同cCHMPS劑量間的比較，肩注相同小寫字母差異不顯著(P>0.05)，肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，cCHMPS與對(duì)照組比較用*表示顯著性差異(P<0.05)，下同

Notes : Comparison of cCHMPS doses between the same genotype groups, Shoulder note same, lowercase letters are not significant difference(P>0.05), and different weight letters indicate significant difference(P<0.05). The difference between cCHMPS and control group was marked by*.The same as below

2.5 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβII基因型雞外周血淋巴細(xì)胞中IL-4 mRNA表達(dá)量

研究表明，與對(duì)照組相比，cCHMPS能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA的表達(dá)，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-4 mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75、50 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時(shí)雞淋巴細(xì)胞 IL-4 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時(shí)，IL-4 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。表3

表3 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞IL-4 mRNA表達(dá)
Table 3 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-4 mRNA expression level

基因型Genotype不同劑量的中藥復(fù)方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1178±003a?179±004a?160±002b?BB基因型 BBGenotype1164±002a?161±003a?171±006b?BC基因型 BCGenotype1166±005a?160±002b?159±002b?

2.6 中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHC B-LβII基因型雞外周血淋巴細(xì)胞中IL-12 mRNA表達(dá)量

研究表明，與對(duì)照組相比，cCHMPS能顯著促進(jìn)雞淋巴細(xì)胞IL-12 mRNA的表達(dá)，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-12 mRNA表達(dá)量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75、50 μg/mL時(shí)，雞淋巴細(xì)胞IL-12 mRNA表達(dá)量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時(shí)雞淋巴細(xì)胞 IL-12 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時(shí)，IL-12 mRNA表達(dá)量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。表4

表4 中藥復(fù)方多糖對(duì)各基因型雞淋巴細(xì)胞IL-12 mRNA表達(dá)
Table 4 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-12 mRNA expression level

基因型Genotype不同劑量的中藥復(fù)方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1219±003a?221±007b?189±004b?BB基因型 BBGenotype1190±004a?186±008a?218±003b?BC基因型 BCGenotype1220±009a?192±003b?196±004b?

3 討 論

3.1 中藥復(fù)方多糖對(duì)雞淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達(dá)量的影響

機(jī)體淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵的作用[7]。淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子是天然的免疫調(diào)節(jié)劑，是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫、炎癥反應(yīng)的一類細(xì)胞小分子糖蛋白，可以使靶細(xì)胞進(jìn)行分化和增殖，進(jìn)一步增強(qiáng)抗疾病的能力，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答[8]。研究細(xì)胞因子有助于了解機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，近年研究發(fā)現(xiàn)中藥多糖可以促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，其中IL-2、IL-4、IL-12等細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答中也充當(dāng)著十分重要的角色。IL-2、IL-4、IL-12主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在細(xì)胞生長(zhǎng)分化和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮著各自特有的作用。IL-2、IL-12是Th1細(xì)胞分泌的，激活巨噬細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞MHC II分子的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)Th細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，最終增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫。IL-2不僅促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增生與分化產(chǎn)生抗體，而且在獲得性免疫和機(jī)體天然免疫的發(fā)生與維持中發(fā)揮著重要作用[9-10]。此外，研究表明雞IL-2蛋白可以作為免疫增強(qiáng)佐劑[11]。IL-4由Th2細(xì)胞分泌，可以抑制Th1細(xì)胞活化的能力，同時(shí)是IgE的誘導(dǎo)劑。IL-12具備多種免疫調(diào)節(jié)功能，不僅可以調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的活性，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答，而且可以促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖及殺傷作用，同時(shí)可以抑制Th2細(xì)胞分泌免疫因子的產(chǎn)生，即Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以抑制Th2細(xì)胞的增殖，反過(guò)來(lái)Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的分化。

有研究表明，中藥多糖能影響白介素，如IL-2、IL-4、IL-12的生成和表達(dá)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[12]。商云霞等[13]研究了中草藥復(fù)方多糖對(duì)雞INF-γ、IL-4和IL-12質(zhì)量濃度的影響，發(fā)現(xiàn)不同劑量中藥復(fù)方多糖均能提高INF-γ、IL-4和IL-12質(zhì)量濃度，且中劑量中藥復(fù)方多糖最好。李婉雁等[14]研究了白術(shù)多糖(PAM)對(duì)嶺南黃雞免疫功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAM能促進(jìn)雛雞免疫器官中TNF-α、IL-2、IL-4及INF-γ mRNA的表達(dá)，且PAM有一定的劑量限制。徐占云等[15]研究了枸杞多糖(LPB)對(duì)雛雞淋巴細(xì)胞體外增殖及分泌IL-2的影響，研究結(jié)果顯示LPB能促進(jìn)雛雞淋巴細(xì)胞增殖和IL-2的分泌。Huang等[16]報(bào)道，地黃多糖能上調(diào)T淋巴細(xì)胞IL-2的分泌水平。另外，還有研究顯示補(bǔ)益類中藥有效成分可以促進(jìn)IL-12、IL-2等細(xì)胞因子分泌，加強(qiáng)細(xì)胞因子的作用，激活B、T細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，而中藥多糖是其中藥成分之一[17]。試驗(yàn)研究表明，不同劑量cCHMPS均能提高各基因型雞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達(dá)量，提示中藥多糖增強(qiáng)機(jī)體抗病能力的分子機(jī)制之一可能是促進(jìn)細(xì)胞因子分泌。當(dāng)然，中藥多糖雖然能促進(jìn)機(jī)體IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達(dá)，但是并非越高越好，三者之間必須處于一定的平衡狀態(tài)，才能維持機(jī)體正常的的體液免疫和細(xì)胞免疫。

3.2 雞MHC B-LβII基因多態(tài)性對(duì)cCHMPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達(dá)的劑量影響

雞MHC基因家族在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著很重要的生物學(xué)功能，同時(shí)雞MHC抗原在體液免疫和細(xì)胞免疫中都發(fā)揮著重要的作用。T細(xì)胞表面有抗原結(jié)合的受體，簡(jiǎn)稱TCR(T cell receptor)。TCR具有特異性，只與特定的抗原結(jié)合， TCR只識(shí)別結(jié)合在自身MHC分子上的抗原。大多數(shù)T細(xì)胞含有CD4和CD8膜分子，表達(dá)的CD4 T細(xì)胞只識(shí)別MHC II類分子遞呈的抗原。CD4 T細(xì)胞作為輔助性T細(xì)胞(Th)，通過(guò)識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)MHC II類分子遞呈的抗原而被活化，活化后的Th細(xì)胞分裂增殖，同時(shí)分泌各種細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。此外，T細(xì)胞在識(shí)別外來(lái)抗原同時(shí)，還要識(shí)別MHC分子，說(shuō)明T細(xì)胞受體在識(shí)別抗原需要依賴與抗原遞呈的MHC分子[18]。

許多研究表明雞多種傳染病的抗性高度與MHC基因多態(tài)性相關(guān)，所以在研究家禽抗病育種試驗(yàn)中MHC基因成為了優(yōu)選的標(biāo)記基因[19]。李福偉等[20]研究表明個(gè)體以及品種之間存在不同免疫能力的遺傳差異，并且不同的免疫性狀存在顯著的優(yōu)勢(shì)基因型。李尚民等[21]的研究發(fā)現(xiàn)雞MHCB-LβII基因外顯子2的遺傳變異對(duì)京海黃雞抗病能力影響顯著，可作為球蟲抗病能力選育候選基因。劉立波等[22]研究了雞MHC B-L基因SNPs單倍體型與血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗體滴度等免疫性狀關(guān)系，結(jié)果表明，不同免疫性狀存在顯著相關(guān)的優(yōu)勢(shì)SNPs單倍型。楊紅洋等[23]研究了中藥復(fù)方多糖對(duì)不同MHCB-LβII基因型雞血清細(xì)胞因子質(zhì)量濃度的影響，發(fā)現(xiàn)MHCB-LβII基因多態(tài)性使雞血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α質(zhì)量濃度產(chǎn)生差異。試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，同一劑量cCHMPS對(duì)不同基因型雞淋巴細(xì)胞的IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達(dá)量不同，此研究結(jié)果與李福偉、李尚民、劉立波、楊紅洋等[20-23]的究結(jié)果相一致，說(shuō)明不同免疫能力存在個(gè)體水平上的差異。試驗(yàn)出現(xiàn)此結(jié)果的原因有可能是MHC II類分子對(duì)中藥多糖的感知有一定濃度范圍，BC基因型雞對(duì)高劑量中藥多糖產(chǎn)生免疫耐受，導(dǎo)致機(jī)體免疫效果低于低劑量的中藥復(fù)方多糖。

但此次試驗(yàn)中，僅僅研究了京紅 1 號(hào)蛋雞，且雞的數(shù)量及免疫相關(guān)指標(biāo)均較少，要確定中藥復(fù)方多糖最適免疫劑量的篩選是否受雞基因多態(tài)性的影響，還需增加雞的品種，擴(kuò)大試驗(yàn)雞的數(shù)量，增加體內(nèi)、體外免疫指標(biāo)，進(jìn)行深入研究。

4 結(jié) 論

中藥復(fù)方多糖能顯著提高機(jī)體免疫力，且50 μg/mL中藥復(fù)方多糖對(duì)AA、BC基因型雞，100 μg/mL中藥復(fù)方多糖對(duì)BB基因型雞淋巴細(xì)胞的免疫效果顯著，提示中藥復(fù)方多糖的免疫增強(qiáng)作用有最適濃度且MHCB-LβII基因多態(tài)性可能影響中藥復(fù)方多糖免疫增強(qiáng)作用的最佳劑量，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，確定添加50 μg/mL的中藥復(fù)方多糖組對(duì)雞淋巴細(xì)胞的免疫效果最優(yōu)。

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