邊 雪, 王 偉, 崔 凡, 屈俊廷， 李熙英,2*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院；2.延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室:吉林 延吉 133002)

人參銹腐病[Cylindrocarpondestructans(Zinss) Scholten]為人參根部最主要的病害之一，一般發(fā)病率20%～30%，個別嚴(yán)重地塊可達(dá)70%以上[1]。人參銹腐病因厚垣孢子在土壤中以休眠的方式可在無寄主的條件下長期存活，使土壤帶菌，直接影響下一茬人參的種植，造成人參連作障礙[2-3]。目前，人參銹腐病的防治主要采用農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等。韓潤亭等[4]利用氯化苦進(jìn)行人參銹腐病田間防病試驗(yàn)，對人參銹腐病防治效果達(dá)54.78%～70.07%,明顯優(yōu)于多菌靈的防治效果。馬鳳茹等[5]、王麗華等[6]用50%棉隆可濕性粉劑處理土壤防治銹腐病防效顯著，用棉隆處理土壤的參根重量比用多菌靈處理土壤的參根重量高出近1倍, 且不影響人參皂貳的含量。但植物病害化學(xué)防治常導(dǎo)致“3R”問題以及環(huán)境污染、藥害、人畜中毒、農(nóng)田生態(tài)平衡與生物多樣性的破壞等一系列的社會問題[7]。

人參銹腐病生物防治方面[8-14]，主要圍繞人參地土壤微生物多樣性調(diào)查，拮抗菌的分離、鑒定及田間防病試驗(yàn)，拮抗菌發(fā)酵條件研究，現(xiàn)有微生物菌劑應(yīng)用于人參銹腐病防治中等方面進(jìn)行，但未見人參銹腐病生防用的菌劑開發(fā)及效果方面的研究報道。

該試驗(yàn)以楊樹上分離到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌菌株Y-S-Y12以及參地土壤分離到的YBN13和YBN18[15]等拮抗菌菌株制作菌劑并檢測菌劑有效性，以期為人參銹腐病生防菌劑開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試菌

人參銹腐病菌(Cylindrocarpondestructans(Zins.))；供試拮抗菌有Y-S-Y12菌株、YBN13菌株和YBN18菌株。Y-S-Y12菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；YBN13和YBN18菌株為芽孢桿菌屬的細(xì)菌Bacillssp，登錄號分別為JX156418和JX156419。上述病原菌和拮抗菌均由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室保存。

1.2 拮抗菌劑制作

拮抗菌菌株Y-S-Y12、YBN13、YBN18進(jìn)行活化后，在無菌操作臺上用接種環(huán)將拮抗菌接入已滅好菌的裝200 mL KB培養(yǎng)液的三角瓶中(菌量為1接菌環(huán))，在28 ℃、120 r/min 恒溫雙層搖床中振蕩培養(yǎng)5 d后，經(jīng)4 000 r/min離心25 min，得到細(xì)菌菌體。將離心所得的細(xì)菌菌體與100 g的A、B、C 3種營養(yǎng)載體相互混合，每種營養(yǎng)載體混合200 mL菌液中的細(xì)菌菌體。攪拌均勻后，置于室內(nèi)陰暗干燥處，自然風(fēng)干，防止陽光直射。

A、B、C 3種不同的營養(yǎng)載體，配方如下。

A：滑石粉100 g，葡萄糖2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蛋白胨3 g，拮抗菌培養(yǎng)液200 mL中培養(yǎng)的細(xì)菌量。

B：高嶺土100 g，葡萄糖2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蛋白胨3 g，拮抗菌培養(yǎng)液200 mL中培養(yǎng)的細(xì)菌量。

C：活性炭100 g，葡萄糖2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蛋白胨3 g，拮抗菌培養(yǎng)液200 mL中培養(yǎng)的細(xì)菌量。

1.3 菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的檢測

不同菌劑中拮抗菌存活數(shù)的檢測，采用平板計數(shù)法。

具體方法如下：分別在制作菌劑后1、10、20、30、40、50、75和100 d時取菌劑樣品1.00 g，采用梯度稀釋法得到10-4、10-5和10-6濃度的菌劑稀釋液，用移液器分別吸取不同稀釋濃度的稀釋液0.02 mL，滴在預(yù)先備好的KB固體培養(yǎng)基平板上，分別用無菌涂布棒均勻涂于瓊脂平板表面。每一稀釋度重復(fù)5個培養(yǎng)皿。將做好的平板倒置放于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后調(diào)查長出的菌落數(shù)目,計算活菌數(shù)目。

1.4 保存100 d后菌劑對人參銹腐病菌的抑菌作用

制作的不同菌劑保存100 d后，取菌劑樣品1.00 g，加入裝有39 mL無菌水的錐形瓶中，充分振蕩10 min，備用。人參銹腐病菌在PDA平板上活化7 d。用打孔器打出直徑8 mm的人參銹腐病菌菌碟，放入PDA平板中間，人參銹腐病菌菌碟兩邊15 mm處放置已滅菌的濾紙片(d=5 mm)，濾紙片上滴上述菌劑懸浮液0.1 mL，每個處理重復(fù)5個培養(yǎng)皿，只接人參銹腐病菌菌碟為對照。20 ℃恒溫箱培養(yǎng)4 d，測人參銹腐病菌菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率計算公式如下：

1.5 拮抗菌菌劑田間防病試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)Y-S-Y12、YBN13、YBN18、Y-S-Y12+YBN13、Y-S-Y12 +YBN18、YBN13+YBN18等6種菌劑處理，其中,混劑為2種菌劑的1∶1混合物。

試驗(yàn)在吉林省安圖縣大荒溝林場人參地中進(jìn)行。試驗(yàn)用人參苗為2年生苗，選擇大小基本相同，無病菌感染的參苗。移栽時，于40倍液菌劑中浸泡人參苗20 min后撈出，進(jìn)行移栽。

試驗(yàn)地設(shè)14個小區(qū)，每小區(qū)面積30 m2,試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，第1區(qū)組為滑石粉制作的菌劑(A劑型)，第2區(qū)組為高嶺土制作的菌劑(B劑型)。清水中浸泡的苗為對照。種植人參苗的株距10 cm,行距30 cm。進(jìn)行正常管理。

10月中旬，取出參根調(diào)查人參成活株數(shù)、病株數(shù)、參根地徑、根長、根重等(調(diào)查4行，標(biāo)準(zhǔn)株數(shù)為60株)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同拮抗菌劑室內(nèi)保存效果

2.1.1 菌劑中拮抗菌活菌數(shù)目檢測

菌劑在100 d內(nèi)活菌數(shù)目變化見圖1～3。

圖1 Y-S-Y12菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的變化趨勢Fig.1 The change trend of viable bacteria count of the Y-S-Y12

圖2 YBN13菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的變化趨勢Fig.2 The change trend of viable bacteria count of the YBN13

圖3 YBN18菌劑中拮抗菌活菌數(shù)的變化趨勢Fig.3 The change trend of viable bacteria count of the YBN18

由圖1～3可知，用滑石粉、高嶺土、活性炭制作的Y-S-Y12、YBN13和YBN18菌劑中的活菌數(shù)目從第10天開始有不同程度的上升，在第40天達(dá)到頂峰，50 d以后活菌數(shù)目開始緩慢下降。在40 d時，用活性炭制作Y-S-Y12和YBN18菌劑的活菌數(shù)最多，用滑石粉制作的YBN13菌株菌劑活菌數(shù)最多。到100 d時不同菌劑中活菌數(shù)目基本趨于穩(wěn)定，并多于GB20287-2006CHB農(nóng)用微生物菌劑中要求微生物菌劑有效活菌數(shù)目應(yīng)大于2×108cfu/g的標(biāo)準(zhǔn)[16]。

2.1.2 不同菌劑對人參銹腐病菌的抑菌活性

由表1可知， Y-S-Y12 3種菌劑的抑菌率比原菌株培養(yǎng)液有下降趨勢，但Y-S-Y12 A、Y-S-Y12 B菌劑與對照之間沒有顯著性差異， Y-S-Y12 C菌劑的抑菌率顯著低于對照。YBN13 3種菌劑對人參銹腐病菌的抑菌率比原菌株有顯著下降趨勢，下降率達(dá)到了10%左右，但3種菌劑間抑菌率沒有顯著性差異。YBN18 B菌劑抑菌率顯著高于對照，YBN 18 A菌劑的抑菌率和對照之間沒有顯著性差異，YBN18 C菌劑的抑菌率顯著低于對照。

綜上所述，Y-S-Y12和YBN18 2種菌劑在活菌數(shù)目上基本達(dá)標(biāo)，并相差不大；在抑菌率上C菌劑與對照之間有顯著性差異，故Y-S-Y12菌劑和YBN18菌劑可選材料為滑石粉和高嶺土。YBN13 3種菌劑在活菌數(shù)目和抑菌效果上相差不大，故YBN13菌劑可選材料為滑石粉、高嶺土和活性炭。

表1 不同菌劑對人參銹腐病菌的抑菌活性

2.2 高效拮抗菌菌劑的田間防病試驗(yàn)

2.2.1 不同拮抗菌菌劑處理對人參銹腐病病情指標(biāo)的影響

田間病情調(diào)查結(jié)果見表2。

表2 不同拮抗菌菌劑對人參銹腐病的病情指標(biāo)的影響

對表2中的人參苗成活株數(shù)和銹腐病病株數(shù)進(jìn)行方差分析的結(jié)果表明，成活株數(shù)和病株數(shù)在區(qū)組間沒有顯著性差異，說明用滑石粉和高嶺土制作的菌劑對人參苗成活率和人參銹腐病發(fā)病率沒有影響。不同處理間成活株數(shù)和病株數(shù)之間差異均達(dá)到極顯著水平[F成活株數(shù)=107.428 6>F0.01(2,6)=10.92；F病株率=107.428 6>F0.01(2,6)=10.92]。對人參苗成活株數(shù)進(jìn)行多重比較的結(jié)果表明，Y-S-Y12、YBN13、YBN18、Y-S-Y12+ YBN13、Y-S-Y12+ YBN18菌劑處理的人參平均成活數(shù)顯著高于對照，且它們之間沒有顯著性差異，用YBN13+YBN18菌劑處理的人參的平均成活株數(shù)較少，且與對照之間沒有顯著性差異。

不同拮抗菌菌劑處理人參銹腐病病株數(shù)顯著低于對照，其中,用Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、Y-S-Y12+YBN18菌劑處理的人參銹腐病病株數(shù)最少，平均防效均達(dá)到了70%以上；其次為YBN13菌劑處理的人參銹腐病病株數(shù)，其平均防效為69.89%；再次為YBN 18菌劑；用YBN13+YBN18菌劑處理的人參銹腐病病株數(shù)最多，其平均防效僅為49.96%。

2.2.2 不同拮抗菌菌劑處理對人參產(chǎn)量指標(biāo)的影響

秋季測得的人參產(chǎn)量指標(biāo)見表3。

對表3中的人參根徑、根長和根重進(jìn)行方差分析的結(jié)果，人參平均根徑、平均根長和人參小區(qū)產(chǎn)量在區(qū)組間無顯著性差異，說明用高嶺土和滑石粉制作的菌劑對人參苗生長指標(biāo)沒有顯著性影響。人參根莖、根長及人參小區(qū)產(chǎn)量在不同處理間差異均達(dá)到了極顯著水平[F根徑=21.17>F0.01(2,6)=10.92；F根長=147.63>F0.01(2,6)=42.16；F產(chǎn)量=109.42>F0.01(2,6)=10.92]。

表3 不同拮抗菌菌劑處理對人參產(chǎn)量指標(biāo)的影響

不同菌劑處理對人參根徑的影響進(jìn)行多重比較的結(jié)果表明,用高效拮抗菌菌株Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、YBN12+YBN18、YBN13菌劑處理的人參平均根徑顯著大于對照，且它們之間沒有顯著性差異；YBN13+YBN18菌劑和YBN18菌劑對人參根莖的影響不大，且與對照沒有顯著性差異。

不同菌劑處理對人參根長的影響進(jìn)行多重比較結(jié)果，用菌劑Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、Y-S-Y12+YBN18、YBN13+YBN18菌劑處理的人參平均根長顯著長于對照，并且無顯著性差異； YBN13、YBN18菌劑對人參根長的影響不大，并與對照之間無顯著性差異。

不同菌劑處理對人參產(chǎn)量的影響進(jìn)行多重比較結(jié)果，不同菌劑處理的人參產(chǎn)量顯著高于對照，其中用Y-S-Y12菌劑和Y-S-Y12+YBN13混合菌劑處理的人參產(chǎn)量最高，并且它們之間沒有顯著性差異；其次為YBN13、Y-S-Y12+YBN18、YBN13+YBN18菌劑,并它們之間也沒有顯著性差異。

從人參單根重上看，用菌劑YBN18菌劑處理的人參單根重少于對照外其他處理的人參單根重均高于對照，其中用菌劑Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13、YBN13+YBN18菌劑處理的人參單根重大于對照，其人參單根重比對照多于115%左右。說明這幾種菌劑處理對人參根的生長有一定的促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

微生物菌劑具有無副作用、無殘留、不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，但其在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和保存過程中容易失活，從而降低生物活性。因此，如何保持菌體的活菌數(shù)和生物活性成為微生物制劑研究的主要難題。本文中采用滑石粉、高嶺土、活性炭等3種材料進(jìn)行了拮抗菌(Y-S-Y12、YBN13、YBN18)劑型化，結(jié)果菌劑中拮抗菌活菌數(shù)目100 d內(nèi)超過了GB 20287-2006(農(nóng)用微生物菌劑)[15]標(biāo)準(zhǔn)中的活菌數(shù)目要求。抑菌試驗(yàn)結(jié)果，拮抗菌菌劑制作100 d后抑菌效果并沒有顯著變化。

微生物菌劑有效性與田間防病試驗(yàn)結(jié)果有密切相關(guān)。不同菌劑處理對人參銹腐病病情指標(biāo)影響的研究結(jié)果表明，Y-S-Y12、Y-S-Y12+YBN13和Y-S-Y12+YBN18菌劑對人參銹腐病有較高的防治效果，達(dá)到了72.04%～77.42%。本試驗(yàn)中不同菌劑處理的人參產(chǎn)量指標(biāo)顯著高于對照，其中,用Y-S-Y12菌劑和Y-S-Y12+YBN13混劑處理的人參根莖、根長以及人參產(chǎn)量等指標(biāo)顯著高于其它處理。這說明，菌劑對人參的生長有一定的促進(jìn)作用。這與金海強(qiáng)等[16]用Y-S-Y12菌株、YBN13菌株和YBN18菌株發(fā)酵液處理人參試驗(yàn)中得到的結(jié)果基本一致。

綜合各因素的分析，單個菌劑中Y-S-Y12菌劑對人參銹腐病的防病作用及人參生長的促進(jìn)作用最明顯；單劑和混劑效果上看混劑效果優(yōu)于單劑；混劑中Y-S-Y12+YBN13混劑的效果最佳。

微生物菌劑使用方法有多種，如噴霧、直接施與土壤、移栽后追施等。本文只采用了移栽前參苗浸泡在菌劑溶液中的方法，沒嘗試其它方法,對此有必要進(jìn)一步研究。

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