劉夢琴，許志鋒，李俊華，劉 劍，張紅帥，王煥翔

(1.衡陽師范學院 化學與材料科學學院，湖南 衡陽 421008；2.功能金屬有機材料湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421008)

碳量子點(C-dots)是一類尺寸小于10 nm的新型碳納米材料，表面含有大量的羥基、羧基等水溶性官能團，是近幾年來發(fā)展的一種新型熒光納米材料[1-4]。碳量子點與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比具有熒光強度高、光穩(wěn)定性好、水溶性好、耐光漂白、發(fā)射波長和激發(fā)波長可調控等優(yōu)點。同時，與一些已廣泛使用量子點的熒光納米顆粒相比，又具有毒性低、生物相容性好、制備簡單和小粒徑等特點。因此，碳量子點在生物成像、生物傳感器等領域具有很好的應用前景[5-7]。

小分子巰基化合物如L-半胱氨酸、谷胱甘肽是許多氨基酸和蛋白質重要的組成部分，它們在許多生理學和病理學過程中起著重要作用。L-半胱氨酸(L-cys)在生物體內具有抱合作用，對范圍廣泛的毒物如甲醛、乙醛、氯仿、具有解毒作用，也可以有效地預防和治療放射性傷害，同時也是一種非常理想的自然美白化妝品。因而，研究對L-半胱氨酸的測定具有很好的現(xiàn)實意義。目前測定L-半胱氨酸的方法有高效液相色譜法[8]、流動注射-化學發(fā)光法[9]、電化學法[10]等。這些方法各有優(yōu)點，但存在操作繁瑣，儀器設備昂貴等不足。熒光分析法因其靈敏度高、方便快捷、經濟，在諸多方法中具有明顯的優(yōu)勢。

目前，基于量子點(QDs)熒光猝滅-恢復現(xiàn)象建立的分析方法多有報道[11-13]。但是多數(shù)工作所用的QDs都含有有毒重金屬元素Cd、Ni、Te、Pb 等，生物相容性是這種納米材料在臨床應用上的瓶頸。本文采用乙二醇為穩(wěn)定劑，用電解的方法制備毒性低、生物相容性好、合成簡單和粒徑小的碳量子點，通過熒光猝滅-恢復技術建立測定L-半胱氨酸，提出一種快速、靈敏測定L-半胱氨酸的新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

JEOL-1230型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；UV-2501PC型紫外分光光度計(日本島津)；RF-5301PC 熒光分光光度計(日本島津)，狹縫寬度均為10 nm；pHS-3E型酸度計(江蘇江分電分析儀器有限公司)。

乙二醇(AR，天津市大茂化學試劑廠)；L-半胱氨酸(AR，天津市光復精細化工研究所)；硝酸汞(AR，貴州省銅仁化學試劑廠)；其它試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。

1.2 C-dots的制備

第一步：制備電解質溶液；取150 mL乙二醇和2.0 g氫氧化鈉(用少量蒸餾水溶解)混合，作為電解質溶液。

第二步：電解；在電解質溶液中浸入兩個大的鉑片電極，保持電解電壓為30 V，電流為1 A，恒溫為60 ℃的條件下充分攪拌電解1.5 h至溶液為深棕色，冷卻至室溫。

第三步：調節(jié)pH值；電解后的溶液，用6 mol/L鹽酸調節(jié)pH至中性。

第四步：透析；用1000 Da的透析袋透析兩天且一天兩次更換蒸餾水，制得表面富含大量羥基、羧基等水溶性官能團的深棕色碳量子點(C-dots)。

1.3 測定方法

研究Hg2+對碳量子點熒光猝滅作用時，在25 mL容量瓶中加入10 mL C-dot，依次加入不同濃度的Hg2+標準溶液，再加入pH 5.0的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，用蒸餾水定容后測定熒光強度。在研究L-半胱氨酸和Hg2+的相互作用時，在25mL容量瓶中加入10 mL C-dot，加入pH=5.0的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL，加入 1.0 mL 5 μmol/LHg2+，搖勻靜置1分鐘后，加入不同濃度的L-半胱氨酸溶液，用蒸餾水定容測定熒光強度。在 358 nm 激發(fā)下測定 444 nm 處熒光強度,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為 10 nm。

2 結果與討論

2.1 C-dots的表征

對制備的C-dots進行了形貌、結構和光學性質表征。利用透射電子顯微鏡(TEM)表征了碳量子點的形貌，結果如圖1所示，C-dots 呈球形，具有很好的分散性，粒徑為2.5～5.5 nm，且集中分布在2.5～4.5 nm粒徑范圍內。

圖1 A：C-dots的透射電子顯微鏡圖；B ：C-dots的粒徑分布圖Fig.1 A：TEM image of C-dots;B：Diameter interval distribution;

圖2為分散在水溶液中C-dots的紫外-可見吸收光譜和在不同激發(fā)下熒光光譜。A圖為C-dots的吸收光譜，表明在波長為263 nm處有強吸收峰，這是電子π-π*躍遷的結果；室溫下的C-dots溶液呈透明的棕黃色，紫外燈下該溶液為深藍色(A插圖)，表明該粒子其熒光量子產率高。圖B為C-dots的熒光光譜圖，表明C-dots在最大激發(fā)波長358 nm激發(fā)下，最大發(fā)射波長為444 nm，從圖中可看出熒光發(fā)射峰峰形對稱，說明合成的碳量子點有穩(wěn)定的光學性質。圖C為在不同波長(348-398 nm)激發(fā)下，C-dots的熒光光譜，表明C-dots在358 nm激發(fā)下，具有最大的熒光強度。

2.2 Hg2+對C-dots熒光的猝滅作用

室溫下，Hg2+對C-dots熒光的猝滅是一個快速的過程，在 10 min 內猝滅效率達到最大。Hg2+和C-dots混合后,猝滅程度2 h內保持不變。碳量子點熒光猝滅的原因是由于碳量子點表面富含大量的羧基和羥基官能團，與Hg2+形成復合物并覆蓋在碳量子點的表面，通過電荷轉移可以有效地猝滅碳量子點熒光。隨Hg2+濃度增大，猝滅程度增大(如圖 3A)，并符合 Stern-Volmer 方程(如圖3B)。其方程為 I/I0=0.886 8-5.3×10-2CHg2+(R2=0.991 05)，其中I0、I分別是無Hg2+和有 Hg2+時C-dots的熒光強度，C為Hg2+濃度。

圖2 A：C-dots的吸收光譜；B：C-dots的熒光光譜；C：在不同波長激發(fā)下，C-dots的熒光光譜；Fig.2 A:Absorption spectra of C-dots;B：Fluorescence spectra of C-dots;C：Fluorescence spectra of C-dots at different wavelengths

圖3 A:Hg2+ 對C-dots的熒光猝滅；B:CHg2+的線性關系Fig.3 A：Fluorescence spectra of Hg2+ quenched C-dots；B：Calibration plot of Hg2+concentration CHg2+：0.2，0.4，0.8，1，2，4，8，10 μmol/L respectively.

2.3 L-半胱氨酸對 C-dots-Hg2+體系熒光的恢復

將L-半胱氨酸加入C-dots-Hg2+體系后，C-dots的熒光明顯恢復(如圖 4)。在pH5.0的磷酸鹽緩沖溶液中，碳量子點表面富含大量的羧基和羥基官能團，實驗條件下帶負電荷,而Hg2+帶正電荷，兩者之間可以通過電荷作用和絡合作用結合，形成復合物并覆蓋在碳量子點的表面，通過電荷轉移可以有效地猝滅碳量子點熒光。而當有L-半胱氨酸存在時，由于巰基與汞離子發(fā)生絡合作用，形成不溶性的硫醇鹽，使汞離子從碳量子點的表面脫落下來，因而碳量子點的熒光得以恢復，且在一定的濃度范圍內，相對熒光強度與L-半胱氨酸的濃度呈線性關系。

圖4 L-cys對 C-dots-Hg2+體系熒光的恢復Fig.4 Fluorescence recovery system of L-cys on the C-dots-Hg2+a: 10mL C-dots + 2.0 mL pH5.0的磷酸鹽緩沖溶液；b: a+1.0mL 5 μmol/L Hg2+ +2.0 mL 40 μmol/L L-cys；c: a+1.0mL 5 μmol/L Hg2+

2.4 優(yōu)化測定條件

2.4.1 溫度的影響

在溫度分別為18 ℃和29 ℃考察了溫度的影響。結果表明，溫度升高，碳量子點的熒光強度減弱，但Hg2+的濃度與熒光強度猝滅程度仍呈現(xiàn)良好的線性關系，因此整個實驗中保持溫度18 ℃。

2.4.2 碳量子點用量的影響

為優(yōu)化碳量子點用量，將不同用量的碳量子點和5 μmol/L Hg2+溶液混合，再加入40 μmol/L L-半胱氨酸。結果表明，當碳量子點用量為10 mL時，碳量子點的熒光恢復效率最大，故實驗選用碳量子點的用量10 mL。

2.4.3 Hg2+濃度的影響

當體系的熒光強度很強時，Hg2+濃度過低的加入，熒光猝滅效率較低，導致分析的靈敏度低，熒光恢復范圍較窄，L-半胱氨酸檢測的線性范圍窄；當Hg2+濃度過高的加入，L-半胱氨酸首先跟游離的Hg2+結合，而與碳量子點表面吸附的Hg2+結合減少，降低了L-半胱氨酸對Hg2+的結合能力，影響碳量子點的熒光恢復程度。為兼顧靈敏度、碳量子點的熒光恢復猝滅效率和線性范圍，實驗選用Hg2+濃度為5 μmol/L。

2.4.4 pH對C-dots熒光恢復效率的影響

為獲得較好的猝滅和恢復效果，研究了不同pH磷酸鹽緩沖溶液對C-dots熒光恢復效率的影響。按照實驗方法將10 mL C-dots、1.0 mL 5 μmol/L Hg2+和2.0 mL 40 μmol/L L-cys 溶液混合均勻后，測定熒光光譜。我們發(fā)現(xiàn)在pH5.0時，C-dots的熒光恢復效率最大，且熒光強度穩(wěn)定。故實驗選用pH5.0作為測定L-半胱氨酸的最佳pH。

2.4.5 孵育時間對熒光恢復的影響

我們發(fā)現(xiàn)加入L-半胱氨酸后，熒光強度迅速增大，5 min內熒光強度即趨于穩(wěn)定，且20 min內熒光強度基本不變。但隨著孵育時間的延長，碳量子點熒光的恢復效率漸降低，故實驗中，L-半胱氨酸和碳量子點-Hg2+體系孵育5 min后測定,并在 20 min內完成測定。

2.5 共存物質的影響

在優(yōu)化的實驗條件下對多種共存物質進行了干擾實驗。當允許相對誤差為±5 %內，L-半胱氨酸的濃度為40 μmol /L 時，各共存物質的允許量見表1。

表1 共存物質對L-半胱氨酸測定的影響Table 1 Effects of coexisting substances on the determination of L-cys

2.6 工作曲線、檢出限與精密度

在最佳試驗條件下獲得L-半胱氨酸濃度與碳量子點熒光恢復強度之間關系。L-半胱氨酸濃度在6.4～80 μmol/L與碳量子點熒光恢復強度呈良好的線性關系，線性回歸方程為I/I0=0.00887C(μmol/L)+0.9476，r=0.9982，方法檢出限(S/N=3)為2.3 μmol/L，對40 μmol/L 的L-半胱氨酸溶液進行5次平行測定，相對標準偏差(RSD)為1.69 %。

表2 本法與文獻方法對比Table2 Comparison between this method and document method with the determination of L-cys

2.7 樣品及回收率測定

準確稱取1.568 7 g市售蜂蜜于燒杯中溶解，再轉移于50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度并搖勻。移取一定量的樣品溶液按實驗方法測定，用標準曲線法計算含量并進行加標回收實驗，測定結果列于表3，L-半胱氨酸的回收率為97.4 %～102.4 %，相對標準偏差(RSD)為1.8 %～3.6 %。

表3 樣品分析結果及回收率Table3 Determination results of L-cys in samples and recoveries

3 結 論

本文在堿性條件下，以乙二醇為前軀體，通過一步電解法合成了水溶性好、毒性低、穩(wěn)定性高且表面富含大量羥基、羧基等水溶性官能團的熒光納米材料碳量子點。在Hg2+存在下，可以有效地猝滅碳量子點熒光；而當有L-半胱氨酸存在時，碳量子點的熒光恢復。利用碳量子點熒光猝滅-恢復技術，建立了測定L-半胱氨酸新方法。該方法具有良好的選擇性，靈敏度高、操作簡單，適用于蜂蜜等樣品中L-半胱氨酸的測定，具有較好的實用價值。

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(編校 陳志敏)