王芳宇，戴俊斌，譚 瀟，何麗芳，王德平，李玉林

(1.衡陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，功能金屬有機(jī)材料湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421008；2.南華大學(xué) 藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；3.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

激肽釋放酶(Kallikreins,KLKs)是具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶特異性的絲氨酸蛋白酶，其編碼基因定位于19q13.4，編碼15個(gè)分泌型絲氨酸蛋白酶KLK 1-KLK 15[1]。已經(jīng)證明，KLKs存在于正常人的皮膚角質(zhì)層細(xì)胞中，目前發(fā)現(xiàn)，至少有8種KLK(KLK 5,KLK 6,KLK 7,KLK 8,KLK 10,KLK 11,KLK 13和KLK 14)存在于人的角質(zhì)層和汗液中，其中KLK7占總量的40 %。KLK7可能是皮膚損傷的一個(gè)關(guān)鍵酶，而且在特應(yīng)性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)病人中它可能參與一個(gè)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，在AD的角質(zhì)層KLK7升高最為突出[2]，這提示KLK7在AD的發(fā)病機(jī)制上可能是至關(guān)重要的，因此，抑制KLK7的活性對(duì)于AD的治療顯得最為重要。

本研究以KLK7作為靶分子，根據(jù)KLK7的晶體結(jié)構(gòu)，采用美國(guó)ChemDiv化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬篩選，挑選能與KLK7催化域匹配結(jié)合的化合物(3 000個(gè)分子)，然后對(duì)3 000個(gè)分子進(jìn)行人工挑選，挑選時(shí)綜合考慮化合物與靶蛋白的結(jié)合模式、預(yù)測(cè)的親合性數(shù)據(jù)以及成藥性指標(biāo)，進(jìn)一步得到300個(gè)分子。分析這300個(gè)分子對(duì)KLK7的抑制作用，以期得到具有較好抑制活性的小分子，作為AD治療的藥物先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

有機(jī)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)：ChemDiv 公司提供的有機(jī)小分子化合物篩選庫(kù)，約含 105萬(wàn)個(gè)有機(jī)小分子化合物。

小分子化合物：美國(guó)TOPSCIENCE公司；

激肽釋放酶7(Recombinant Human Kallikrein 7 ：R&D； MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2：R&D；

多功能熒光酶標(biāo)儀：Bio-tek公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 計(jì)算機(jī)虛擬篩選

以KLK7作為靶分子，根據(jù)KLK7的晶體結(jié)構(gòu)，采用美國(guó)ChemDiv化合物數(shù)據(jù)庫(kù) (1 044 623個(gè)分子)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬篩選。分兩步進(jìn)行，第一步基于藥效團(tuán)模型進(jìn)行篩選，共得到342 366個(gè)化合物；第二步，對(duì)獲得的化合物進(jìn)行分子對(duì)接篩選，挑選與KLK7催化域匹配結(jié)合效果好的化合物(3 000個(gè)分子)(虛擬篩選委托上海陶素生化技術(shù)有限公司完成)。

1.2.2 人工挑選

對(duì)虛擬篩選中排名靠前的3 000個(gè)化合物進(jìn)行人工挑選，挑選時(shí)綜合考慮化合物與靶蛋白的結(jié)合模式、預(yù)測(cè)的親合性數(shù)據(jù)以及成藥性指標(biāo)。最終挑選匹配效果最好的前300個(gè)化合物分子(Top300)進(jìn)行后續(xù)的研究。

1.2.3 Top300小分子化合物對(duì)KLK7的抑制效果分析

KLK7分別與小分子化合物在37 ℃下作用15分鐘，然后加入KLK7的熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2，15分鐘(37 ℃)后測(cè)酶活性。不含小分子化合物的為陰性對(duì)照，計(jì)算抑制率=(1-a/b)×100 %，a為待測(cè)樣品的酶活，b為陰性對(duì)照的酶活。

1.2.4 化合物IC50的測(cè)定

選取抑制率高的化合物設(shè)置成6.5、12.5、25、50、100和200 μM等6個(gè)濃度梯度，分別與KLK7 在37 ℃下作用15分鐘，然后加入KLK7的熒光底物MCa-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2，15分鐘(37 ℃)后測(cè)酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 Top300小分子化合物的獲得

重新dock Top3000分子，得到Score和RMSD值。Score代表對(duì)docking的打分，Score值越小越好。RMSD代表dock后分子構(gòu)象與起始構(gòu)象的差別。對(duì)Score值根據(jù)分子量作修正，得到revised Score值。以revised Score為X軸，RMSD值為Y軸作圖，如圖1。在圖1作輔助線，以輔助線為軸，越靠近圖表左下方的分子，它的Score值與RMSD值越小，分子預(yù)測(cè)效果越好。反之，越靠近右上方的分子它的Score值與RMSD值越大，分子預(yù)測(cè)效果越差。將所有分子的坐標(biāo)投影到輔助線上得到projection value，然后排序，挑選Top300個(gè)分子 (表1)。

圖1 revised Score與RMSD值之間呈微弱正相關(guān)

表1 挑選的Top300分子

續(xù)表

續(xù)表

NameWeight/DaRankNameWeight/DaRankD463?0253425 5499E612?0534423 51249F109?1335413 51100Y020?1010421 49250G284?1264401 5101E225?0558510 58251E223?0621504 58102C677?0059445 58252C592?3493485 6103F154?0022518253C753?1688438 56104C260?1232528 6254F594?0887463 611055498?2769490 57255E984?2605465 98106F036?0047469 58256K630?0051471 48107D715?1638400 47257C260?1644534108E225?1022526 65258F142?0451516 56109C064?0446567 74259K284?2518525 62110E228?2761430 47260F036?0054455 55111G907?1193490 61261P349?2557439 87112K405?1719445 44262K242?1041461 51113G213?0382435 58263G381?0202419 54114F680?0588463 98264G696?5989460 54115G622?0932431 46265E223?0887505 03116C241?1975536 62266F109?1495413 51117C445?0306556 61267F120?0101418 92118G696?5717442 55268G319?0120497 61119F036?1966488 55269K286?3997565 691205228?0720394 49270F142?0534455 55121F154?0371524 63271F796?0212431 491226850?0227467 63272E756?0186495 56123C260?1089563273G015?1221497 631244013?0064436 5274C260?2081549 02125G819?0203485 6275C753?0532437 53126F061?1420511 61276F936?0671452 56127G907?1361490 61277F036?1054457 5128C796?0561527 68278F111?1301423 51129K784?5776421 53279C260?1473542 63130E856?3076487 59280C260?2165530 66131G581?0417459 582815055?9164486 57132C800?0835394 53282C880?1473480 56133M461?3026491 97283C880?0756493 6134G803?0555409 43284C064?0047591 74135E228?2817448 53285L112?0742470 59136G629?0241546 66286G546?0749486 01137D223?0658478 5287E856?3108487 59138G932?0753436 51288C879?2400402 53139D704?3047407 472893172?0923482 531401682?8193477 9290E524?1745491 58141G534?0683474 572914013?2686486 63142G572?0184456 56292E225?0740508 61143L690?0717484 55293G581?0361485 53144E002?1609454 56294F142?0652518 631456466?0688475 51295F512?0798411 47146G725?1800436 49296F509?0474464 94147C064?0268504 55297D335?3106386 51148K808?7972371 47298E717?0330485 621494424?0480483 56299G581?0358455 55150C155?0523540 74300

2.2 Top300小分子化合物對(duì)KLK7的抑制效果

1) 200 μM濃度下篩選得到13個(gè)對(duì)KLK7抑制效率為100 %的化合物，編號(hào)分別是26,44,47,52,54,63,73,125,138,165,166,251,260；

2)將上步篩選到的13個(gè)化合物的反應(yīng)濃度降低至50 μM，檢測(cè)它們?cè)?0 μM濃度時(shí)對(duì)KLK7的抑制效率，發(fā)現(xiàn)44號(hào)化合物在50 μM時(shí)對(duì)KLK7沒(méi)有抑制作用，其余12個(gè)化合物依然有抑制作用但抑制效率下降，其中%inhibition在50 %以上的化合物有5個(gè)，編號(hào)分別為47,54,125,166,260。

表 2 50 M濃度下13個(gè)化合物對(duì)KLK7的抑制率

注：*表示%Inhibition>50

2.3 抑制率高的五個(gè)化合物對(duì)KLK7的IC50

進(jìn)一步研究50 μM濃度下對(duì)KLK7的抑制率>50 %的五個(gè)化合物對(duì)KLK7的抑制效率，根據(jù)測(cè)得的F.U/h計(jì)算出%inhibition，再根據(jù)% inhibition和抑制劑濃度用KaleidaGraph軟件進(jìn)行曲線擬合，計(jì)算各個(gè)抑制劑對(duì)KLK7的IC50(其中54號(hào)化合物抑制效果檢測(cè)不理想，結(jié)果沒(méi)有列出)。結(jié)果顯示，47號(hào)、125號(hào)、166號(hào)和260號(hào)化合物對(duì)KLK7的IC50依次是：37.166 μM，25.32 μM，28.955 μM，36.078 μM。

表3 47號(hào)化合物檢測(cè)數(shù)據(jù)

表4 125號(hào)化合物檢測(cè)數(shù)據(jù)

表5 166號(hào)化合物檢測(cè)數(shù)據(jù)

表6 260號(hào)化合物檢測(cè)數(shù)據(jù)

3 討 論

近年來(lái)，使用信息工具進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)和虛擬篩選在短時(shí)間內(nèi)來(lái)獲得藥物先導(dǎo)化合物越來(lái)越受到重視。計(jì)算機(jī)工具發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化合物的應(yīng)用可幫助研究人員迅速設(shè)計(jì)和評(píng)估新的藥物。計(jì)算機(jī)資源減少了獲得藥物的時(shí)間和相關(guān)經(jīng)濟(jì)成本，使得在低成本下有靶標(biāo)性地預(yù)測(cè)潛在藥物成為可能[3]。

虛擬篩選依賴分子模擬技術(shù)，從大量的有機(jī)化合物中遴選出可能有效的候選化合物，避免了對(duì)化合物的盲目篩選，從而大大降低了發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物的成本。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)一些重大疾病藥物靶標(biāo)均有許多成功使用虛擬篩選的實(shí)例[4]。從原理上來(lái)講，虛擬篩選可以分為兩類，即基于分子對(duì)接的虛擬篩選和基于藥效團(tuán)的虛擬篩選?；诜肿訉?duì)接的虛擬篩選從靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)出發(fā)，研究靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)的特征性質(zhì)以及它與小分子化合物之間的相互作用模式，根據(jù)與結(jié)合能相關(guān)的親合性打分函數(shù)對(duì)蛋白和小分子化合物的結(jié)合能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終從大量的化合物分子中挑選出結(jié)合模式比較合理的、預(yù)測(cè)得分較高的化合物，用于后續(xù)的生物活性測(cè)試。基于藥效團(tuán)的虛擬篩選一般是利用一系列已知活性的小分子化合物產(chǎn)生一個(gè)與藥物作用對(duì)應(yīng)的藥效團(tuán)模型，然后根據(jù)這個(gè)模型在化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索能夠與它匹配的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)，最后對(duì)這些挑選出來(lái)的化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選研究。

本實(shí)驗(yàn)選用的有機(jī)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)ChemDiv 數(shù)據(jù)庫(kù)，是由 ChemDiv 公司提供的有機(jī)小分子化合物篩選庫(kù)，是目前世界上提供數(shù)量最多，結(jié)構(gòu)具有豐富多樣性的化合物庫(kù)。采用的藥物分子設(shè)計(jì)軟件GOLD (GOLD 軟件套裝5.2版,由英國(guó)Cambridge Crystal Data Center發(fā)行)是由 Sheffield 大學(xué)，GlaxoSmithKline 公司和 Cambridge Crystallographic Data Center(CCDC)共同開(kāi)發(fā)的對(duì)接程序[5]。它采用遺傳算法產(chǎn)生小分子配體的結(jié)合構(gòu)象，分子對(duì)接時(shí)配體是完全柔性的，蛋白分子可以考慮部分柔性。GOLD 程序自帶多種打分函數(shù)，包括GoldScore[6]、ChemScore[7]、ASP[8]。新版中整合了打分函數(shù)ChemScore_Kinase 和ChemScore_PLP。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選得到的300個(gè)小分子化合物，進(jìn)一步檢測(cè)抑制效率較高的化合物并測(cè)定其對(duì)KLK7的IC50。其中47號(hào)、125號(hào)、166號(hào)和260號(hào)化合物對(duì)KLK7的IC50依次是：37.166 μM，25.32 μM，28.955 μM，36.078 μM，說(shuō)明這四個(gè)化合物對(duì)KLK7有較好的抑制作用，可以進(jìn)一步研究。

[1] YOUSEF G M,DIAMANDIS E P.The new human tissue kallikrein gene family:structure,function,and association to disease[J].Endocrine reviews,2001,22(2): 184-204.

[2] KOMATUS N,SAIJOH K,KUK C,et al.Human tissue kallikrein expression in the stratum corneum and serum of atopic dermatitis patients[J].Experimental Dermatology,2007,16(6):513-519.

[3] CUMMING J G,DAVIS A M,MURESAN S,et al.Chemical predictive modelling to improve compound quality[J].Nat Rev Drug Discov,2013,12(12):948-962.

[4] GHOSH S,NIE A H,AN J,et al.Structure-based virtual screening of chemical libraries for drug discovery[J].Curr Opin Chem Biol,2006,10:194-202.

[5] JONES G,WILLETT P,GLEN R C.Molecular recognition of receptor sites using an algorithm with a description of desolvation[J].J Mol Biol,1995,245:43-53.

[6] JONES G,WILLETT P,GLEN R.C,et al.Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking[J].J Mol Biol,1997,267(3):727-748.

[7] ELDRIDGE M D,MURRAY C W,AUTON T R,et al.Empirical scoring functions: I.the development of a fast empirical scoring function to estimate the binding affinity of ligands in receptor complexes[J].J Comput Aided Mol Des,1997,11(5):425-445.

[8] MOOIJ W T,VERDONK M L.General and targeted statistical potentials for protein-ligand interactions[J].Proteins,2005,61(2):272-287.

(編校 陳志陽(yáng))