胡永艷，孔申申

(北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100034)

輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)已廣泛應(yīng)用于人類不育治療及家畜優(yōu)良種質(zhì)資源高效利用。體外受精(invitrofertilization，IVF)是一種關(guān)鍵的輔助生殖技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究中，IVF技術(shù)常用于基因修飾小鼠的制作、冷凍保種、生物凈化以及快速擴(kuò)大繁殖等操作，通過使用IVF技術(shù)能夠大大提高基因修飾小鼠的繁殖效率和品系保存質(zhì)量，保持遺傳背景的穩(wěn)定性。IVF后代同正常受精后代小鼠在遺傳物質(zhì)上幾乎無差異，但目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)證據(jù)表明，IVF后代同正常受精鼠后代在生長(zhǎng)發(fā)育、器官組織生理特性、代謝等不同層面存在差異。本文通過分析綜述IVF對(duì)性別、生長(zhǎng)發(fā)育、行為學(xué)、壽命、器官和組織代謝以及分子表型等的影響，以期對(duì)IVF技術(shù)在基因修飾小鼠快速繁殖、凈化、保種等應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問題提供一定的指導(dǎo)意義。

1 性別比研究

IVF小鼠同自然繁育后代小鼠相比，從植入前到產(chǎn)前階段有顯著的性別差異，IVF小鼠雄性增多。在植入前階段，雌性IVF胚胎似乎更容易受到IVF誘導(dǎo)的影響，包括凋亡百分比顯著增加，經(jīng)典的性別相關(guān)基因的表達(dá)異常(Xist、Hprt、Pgk1和Hsp70)。在妊娠中期，胚胎第13.5天(E13.5)IVF雄性胎兒的生存率高于IVF雌性胎兒(雄∶雌=1.33∶1)，伴有雌性偏倚的妊娠丟失。妊娠晚期，E19.5 IVF雄性胎鼠性別比高(雄∶雌=1.48∶1)。出生后，IVF雄性鼠的生長(zhǎng)速度比其體內(nèi)胚胎雄性對(duì)照鼠高，而IVF雌性與體內(nèi)胚胎雌性呈現(xiàn)相似的生長(zhǎng)模式[1]。

性別比是生殖健康的一個(gè)重要指標(biāo)，其性別失衡反映了胚胎發(fā)育的缺陷。IVF引發(fā)的表觀修飾錯(cuò)誤可能是造成性別失衡的主要原因。小鼠IVF后代的性別比例失衡是由于圍植入期雌性胚胎傾向性的發(fā)育異常所致。有研究發(fā)現(xiàn)雌性IVF附植前胚胎存在Xist表達(dá)抑制和印跡X染色體失活(imprinted X-chromosome inactivation，iXCI)異常的表觀修飾錯(cuò)誤，并發(fā)現(xiàn)在胚胎體外培養(yǎng)液中適時(shí)添加適量的視黃酸可以校正IVF引發(fā)的iXCI不足問題，并有效地校正出生性別比例[2]。

2 生長(zhǎng)發(fā)育影響

胚胎發(fā)育早期的環(huán)境應(yīng)激能夠影響出生后表型，這些生理表型可能出現(xiàn)于成年后。小鼠受精卵在營(yíng)養(yǎng)不充足的培養(yǎng)基中發(fā)育10 h即可改變出生體重和出生后的生長(zhǎng)[3]。Le等[4]以小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用常規(guī)的IVF技術(shù)建立小鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IVF組出生率明顯低于對(duì)照組；IVF組出生體重明顯高于對(duì)照組，而在第2周及第3周時(shí)，出現(xiàn)了相反的結(jié)果，IVF組體重明顯低于對(duì)照組，第4周后直到性成熟期(8～10周)兩組之間又表現(xiàn)為差異無顯著性，表明IVF技術(shù)對(duì)小鼠的早期生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的影響，而隨著生長(zhǎng)發(fā)育這些影響逐漸減少，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)IVF子代早期生長(zhǎng)發(fā)育的監(jiān)督及評(píng)估。另一項(xiàng)研究同樣發(fā)現(xiàn)IVF小鼠出生體重增加[5]，而對(duì)胎鼠的體重研究發(fā)現(xiàn)[6]，ART小鼠在E18.5導(dǎo)致胎兒重量減少和胎盤過度生長(zhǎng)。ART鼠胎盤在E18.5表現(xiàn)出胎盤層分離和糖原細(xì)胞遷移缺陷的組織形態(tài)學(xué)改變，ART操作導(dǎo)致大部分胎盤營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的下調(diào)和胎盤效率的降低。ART胎盤改變與H19、KvDMR1的印跡控制區(qū)的甲基化水平升高相關(guān)，并且破壞了E18.5對(duì)于胎盤發(fā)育和功能重要的絕大多數(shù)印記基因的表達(dá)。小鼠模型的結(jié)果顯示了ART操作可以通過破壞胎盤發(fā)育和功能來影響胎兒生長(zhǎng)的第一個(gè)證據(jù)，表明由胚胎操作引起的基因組印記的改變可能導(dǎo)致這些問題出現(xiàn)。

體重是生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)，文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)由于ART操作導(dǎo)致胎盤效率降低，IVF組在E18.5胎鼠重量減少，而IVF小鼠出生體重增加有表觀遺傳調(diào)控的參與，自胚胎末期至出生體重結(jié)果的變異目前分析可能是由于不同的研究體外培養(yǎng)條件有差異，具體原因有待進(jìn)一步研究。

IVF是否會(huì)影響小鼠壽命方面的研究存在爭(zhēng)議，有研究發(fā)現(xiàn)正常飲食的小鼠壽命沒有差異[7]，也有研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼喂高脂飲食的ART小鼠的壽命縮短約25%，且表觀遺傳改變導(dǎo)致了這些問題的出現(xiàn)[8]。

3 行為影響

多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)IVF操作與小鼠的行為和焦慮水平相關(guān)[9-10]。研究人員起初發(fā)現(xiàn)IVF操作會(huì)引起后代的行為學(xué)異常[9, 11]，這些研究表明IVF出生的小鼠分窩前行為學(xué)表型較少改變，但是成年后在焦慮、自主運(yùn)動(dòng)、空間和內(nèi)隱記憶等方面改變明顯。例如，IVF小鼠在高架十字迷宮的開放臂中停留更多的時(shí)間，表明其焦慮水平降低，這一行為差異在雄性小鼠中尤為明顯，并伴隨在焦慮相關(guān)的皮質(zhì)和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)以及小腦中的單胺氧化酶A基因、促皮質(zhì)素釋放因子和γ-丁胺酸表達(dá)改變[10]，這三個(gè)基因已被證明是焦慮和恐懼行為的調(diào)控因子[12]，它們與其相關(guān)受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改變與焦慮水平的變化相關(guān)[13]。

4 器官與組織代謝

4.1 肝臟

ART小鼠老年時(shí)期的肝臟重量顯著增加，且添加了胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)過的雌鼠肝臟脂肪變性，雄性和對(duì)照很少出現(xiàn)脂肪變性[9]。研究發(fā)現(xiàn)了膽汁酸代謝、蛋白質(zhì)泛素化、線粒體功能障礙和氧化磷酸化的變化轉(zhuǎn)錄證據(jù)，以及可能反映細(xì)胞對(duì)治療反應(yīng)差異的基因錯(cuò)誤表達(dá)[14]。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示了改變蛋白水解作用和蛋白質(zhì)泛素化證據(jù)——二肽濃度顯著增加，活化蛋白激酶的變化，三磷酸腺苷和三磷酸鳥苷-需能反應(yīng)(增加嘌呤代謝物如腺苷酸、鳥苷酸和鳥苷)和減少膽汁酸儲(chǔ)存量。損害膽汁酸的合成以致膽汁酸儲(chǔ)存量減少，最終明顯減少能量消耗，導(dǎo)致肥胖和糖尿病的發(fā)生[9, 15]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)IVF鼠的肝臟中葡萄糖代謝物的含量降低，而糖原中間體的含量增加，谷氨酰胺減少，長(zhǎng)鏈脂肪酸減少，這反映出線粒體功能的改變。在另一項(xiàng)研究中，IVFKAA(使用具有氨基酸和5% O2的KSOM優(yōu)化培養(yǎng)基)和自然懷孕胎鼠肝臟的脂類組學(xué)分析顯示增加了幾個(gè)與葡萄糖代謝及血管功能異常相關(guān)的磷脂，包括溶血磷脂酰膽堿、磷脂酸和溶血磷脂酰乙醇胺，它們可能導(dǎo)致IVF小鼠出生后某些可能的代謝異常[16]。

4.2 脂肪組織

IVF普遍導(dǎo)致胎盤脂質(zhì)代謝及其代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因表達(dá)異常，IVF所致的與脂質(zhì)代謝相關(guān)的印記基因印記紊亂以及印記維持關(guān)鍵基因表達(dá)水平異常可追溯到植入前胚胎。植入前期是重新編碼的時(shí)期，可能容易受到破壞。有研究發(fā)現(xiàn)IVF出生的小鼠早期生理表型正常，但是成年后會(huì)出現(xiàn)脂肪組織顯著增加。研究表明IVFKAA雌鼠成年后更容易脂肪沉積[15]。轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化的基因多與脂類代謝、能量生成(如糖異生、三羧酸循環(huán))以及胰島素受體信號(hào)通路、白介素-1信號(hào)通路和類視黃醇X受體/肝X受體和類視黃醇X受體/法尼酯X受體的異二聚體的激活相關(guān)。雄性和雌性性腺脂肪的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與脂肪生成有關(guān)的促炎性和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)代謝產(chǎn)物雌性特異地增加[17-19]。

脂肪是代謝異常的主要驅(qū)動(dòng)，所以IVF小鼠脂肪組織性別差異可能導(dǎo)致性別特異的代謝表型。兩種性別的IVFKAA小鼠皆保有脂肪特有的存在，與其他成年組織相比，IVF囊胚中的轉(zhuǎn)錄變化，包括糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)和硫氧環(huán)蛋白相互作用蛋白增加[20]。這些數(shù)據(jù)提示脂肪組織可能是IVF小鼠性別和組織特異性變化的作用場(chǎng)所。

4.3 胰島

IVF小鼠成年期通常有較高的空腹血糖并伴有葡萄糖不耐受[14]，IVFKAA動(dòng)物表現(xiàn)出低胰島素生成指數(shù)(葡萄糖耐量試驗(yàn)中前30 min的血漿胰島素水平變化除以葡萄糖水平變化)[21]，表明由于β細(xì)胞對(duì)葡萄糖不敏感，IVF小鼠應(yīng)對(duì)葡萄糖分泌胰島素的能力降低[5]。進(jìn)一步的研究表明，與對(duì)照組相比，IVF雌鼠在29周的時(shí)間內(nèi)體重標(biāo)準(zhǔn)化的胰腺重量較低。與其他胰島素敏感組織相比，胰島的芯片分析在基因表達(dá)上的變化更少，最顯著的變化是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達(dá)的顯著下調(diào)，GAPDH的減少、ROS的增加是糖尿病周圍組織和β細(xì)胞引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵通路[22]。β細(xì)胞功能障礙隨年齡的增加而增加，有研究表明12周齡的IVF雌鼠在葡萄糖刺激下胰島素分泌正常，但是29周時(shí)，IVF小鼠胰島表現(xiàn)出基礎(chǔ)胰島素分泌增加，并且應(yīng)對(duì)高糖刺激引起的胰島素分泌增加不明顯[21]。ART小鼠出生后葡萄糖體內(nèi)平衡可能具有性別二態(tài)性[22]。有研究對(duì)斷奶后IVF小鼠高脂喂養(yǎng)8周，發(fā)現(xiàn)它們空腹血糖水平升高，葡萄糖耐量受損以及胰島素刺激引起的Akt磷酸化減少[23]。

4.4 血管組織

Rexhaj等發(fā)現(xiàn)IVF出生的FVB雄鼠脈管系統(tǒng)的內(nèi)皮功能紊亂、硬度增加，伴隨雄性隔代遺傳的動(dòng)脈高血壓[8]。血管表型能夠跨代遺傳顯示表觀遺傳在其中發(fā)揮作用，但有待進(jìn)一步證實(shí)。研究者進(jìn)行了定向分析，并發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因啟動(dòng)子甲基化改變，及血管中eNOS表達(dá)和一氧化氮(nitric oxide，NO)合成降低。另一個(gè)關(guān)于血壓的評(píng)估同樣發(fā)現(xiàn)IVF出生的CF1×B6D2F1雄鼠收縮壓降低、舒張壓與自然生產(chǎn)對(duì)照鼠一樣[5]。但是，另一個(gè)研究結(jié)果表明胚胎培養(yǎng)后收縮壓升高[24]。結(jié)果差異的復(fù)雜性與小鼠品系、血壓測(cè)量方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(例如在Rexhaj等[8]的研究中沒有對(duì)每窩的產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行控制)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)由ART產(chǎn)生的小鼠的脈管系統(tǒng)顯示內(nèi)皮功能障礙和血管硬度增加，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為動(dòng)脈高血壓。雄性ART小鼠的后代也顯示血管功能障礙，這表明ART鼠的遺傳物質(zhì)受到了表觀遺傳修飾。給予ART小鼠脫乙酰酶抑制劑后血管基因甲基化和功能恢復(fù)正常，以致子代小鼠沒有血管功能障礙。ART相關(guān)血管和表觀遺傳改變的誘因似乎與胚胎環(huán)境有關(guān)，這些改變可能通過伴隨ART的激素刺激排卵來促進(jìn)[8]。

小鼠在妊娠期間營(yíng)養(yǎng)不良可通過表觀遺傳機(jī)制引起后代的肺血管功能障礙，而IVF即可能會(huì)造成小鼠胚胎早期的營(yíng)養(yǎng)不良。在大鼠中，懷孕期間的限制性飲食(restrictive diet during pregnancy，RDP)增加了胎盤中的氧化應(yīng)激。氧化物誘導(dǎo)表觀遺傳改變，并且可能穿過胎盤屏障，所以一項(xiàng)研究檢測(cè)了缺氧2周后RDP和對(duì)照小鼠后代的肺血管功能和肺DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)體外內(nèi)皮依賴性肺動(dòng)脈血管舒張受損，體內(nèi)低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓和右心室肥大在RDP后代中更加顯著。給予組蛋白脫乙酰酶抑制劑丁酸鹽和曲古抑菌素A后RDP后代的肺DNA甲基化和血管功能恢復(fù)正常。最后，在RDP期間向孕鼠施用氮氧化物tempol可防止后代的血管功能障礙和異位甲基化[25]。

4.5 心臟

與對(duì)照組相比，封閉群IVFWM雄鼠的血壓偏低，但是超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示它們心臟收縮末期和舒張末期的體積增大[24]。超聲心動(dòng)圖分析還發(fā)現(xiàn)IVF和胞質(zhì)內(nèi)精子注射的幼鼠左心室肥大[26]。另一個(gè)研究表明培養(yǎng)條件的差異能夠顯著影響出生后心臟重量，體外培養(yǎng)時(shí)加入FCS的小鼠在20月齡時(shí)心臟重量顯著增加[9]。盡管大部分心臟幾何形態(tài)參數(shù)在各個(gè)研究組中是可以比較的，IVF后代在校正了年齡、性別、體表面積和心率后，其左心室相對(duì)壁厚、左心室質(zhì)量指數(shù)和左室重構(gòu)指數(shù)顯著升高。

5 分子表型

許多研究小組報(bào)告了一系列與IVF和胚胎培養(yǎng)有關(guān)的出生后代謝和分子表型。但是考慮到小鼠品系和體外培養(yǎng)條件的差異，很難將多個(gè)研究聯(lián)系到一個(gè)全面的解釋，即植入前的體外暴露如何影響成年表型。有研究組采用多組學(xué)方法，因?yàn)閮H芯片并不總能捕獲所有的基因轉(zhuǎn)錄本或組織/胚胎言行，代謝組學(xué)提供了細(xì)胞過程和轉(zhuǎn)錄改變潛在結(jié)果的實(shí)時(shí)概覽。芯片分析發(fā)現(xiàn)1361個(gè)基因錯(cuò)誤表達(dá)，但是只有16個(gè)基因的表達(dá)差異在兩倍以上，其中包括Ccl7、Ccl19、Chd7、Cnnm2、Il17ra、Il1rb、Gfpt2和Ngf，主要集中在炎癥反應(yīng)信號(hào)通路、細(xì)胞組裝和組織、癌癥、細(xì)胞間的信號(hào)傳遞、相互作用和運(yùn)動(dòng)等[27]。值得注意的是，相似的結(jié)果在自然出生和ART出生的兒童的心臟功能分析中有報(bào)道[28]。芯片研究結(jié)果顯示超過35個(gè)錯(cuò)誤表達(dá)基因反映了GR信號(hào)上調(diào)，這是值得注意的，因?yàn)椴贿m當(dāng)?shù)奶瞧べ|(zhì)激素信號(hào)可以影響生長(zhǎng)、對(duì)慢性疾病的易感性，以及誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)。糖皮質(zhì)激素的升高也與心血管疾病和糖尿病的易感有關(guān)[29]。IVF轉(zhuǎn)錄信號(hào)豐富的其他信號(hào)通路包括細(xì)胞間通信和運(yùn)動(dòng)，也包括NO和ROS的產(chǎn)生[28]。

比較E3.5、E7.5和E10.5三個(gè)重要發(fā)育階段的體內(nèi)胚胎和IVF胚胎的microRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)失調(diào)的microRNAs主要參與調(diào)控與癌癥發(fā)生、遺傳信息加工、葡萄糖代謝、細(xì)胞骨架組成及神經(jīng)發(fā)生等過程相關(guān)的基因，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IVF組胚胎中僅有miR-199 a-5p從E3.5到E10.5持續(xù)低表達(dá)。通過功能性缺失與補(bǔ)償性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)IVF引發(fā)的miR-199 a-5p低表達(dá)是造成IVF胚胎糖酵解率高、發(fā)育潛能降低、附植后胚胎存活率低的主要原因[2]。

綜上所述，ART小鼠可能在性別比例、生長(zhǎng)發(fā)育、行為、某些器官與組織代謝以及分子等表型方面存在某些異常，對(duì)于這些異常，尤其是性別比例和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的異常，研究結(jié)果存在一些多樣性，仍然需要更多的研究來驗(yàn)證它們，以排除不同研究者觀察的IVF小鼠樣本量的大小、動(dòng)物健康及飼養(yǎng)管理水平等非IVF因素等帶來的干擾。而且這些異常大部分出現(xiàn)在進(jìn)行了胚胎體外操作出生的那一代小鼠，針對(duì)IVF后代可能出現(xiàn)的一些健康問題，仍需要大量研究探索，進(jìn)而根據(jù)具體情況合理使用該技術(shù)，或者提出針對(duì)性的解決方案，最終實(shí)現(xiàn)ART更加安全有效的應(yīng)用。盡管有一些瑕疵，但是ART技術(shù)現(xiàn)在并且以后仍然會(huì)在基因修飾小鼠制作、冷凍保種、生物凈化等方面對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮非常重要的作用。

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