劉佳+傅強(qiáng)+袁媛+宋影瑩+侯莉莉

【摘要】 目的：探討外周淋巴細(xì)胞凍存技術(shù)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）主動(dòng)免疫治療的臨床效果。方法：對(duì)2014年11月-2016年1月經(jīng)本院中醫(yī)科門診確診的77例RSA患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，所有濃縮白細(xì)胞通過無償獻(xiàn)血方式獲得，進(jìn)一步采用Ficoll密度梯度離心法分離淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞經(jīng)自體血漿凍存，深低溫保存，分次復(fù)蘇后用于RSA患者主動(dòng)免疫治療。通過臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)比較凍存不同時(shí)期淋巴細(xì)胞存活率和CD3+T、CD3+CD8+T和CD3+CD4+T細(xì)胞免疫表型變化，評(píng)價(jià)凍存淋巴細(xì)胞的活性和穩(wěn)定性；通過比較治療前后RSA患者HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率和再次妊娠成功率，評(píng)價(jià)凍存外周淋巴細(xì)胞用于RSA治療的效果。結(jié)果：與新鮮分離的淋巴細(xì)胞比較，存活7、15、30、60、90 d的淋巴細(xì)胞存活率和細(xì)胞表型穩(wěn)定性比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；經(jīng)凍存淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后，封閉抗體累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率為93.5%。封閉抗體陽(yáng)性者再次妊娠成功率為90.3%，顯著高于陰性者的20.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)自體血漿凍存，深低溫保存后，不影響細(xì)胞存活率和穩(wěn)定性，且對(duì)RSA患者治療效果明確。此外，此法獲得的淋巴細(xì)胞來源安全、可靠，患者依從性高，且可一定程度緩解臨床血液制品來源困難的處境，具有進(jìn)一步臨床推廣使用的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 外周淋巴細(xì)胞； 冷凍保存； 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)； 主動(dòng)免疫治療

【Abstract】 Objective：To explore the clinical efficacy of peripheral lymphocyte cryopreservation technique for lymphocyte active immunotherapy（LIT） in the treatment of recurrent spontaneous abortion（RSA）.Method：The clinical data of 77 patients with RSA who had been diagnosed with traditional Chinese medicine from November 2014 to January 2016 were retrospectively analyzed.All the concentrated white blood cells were obtained by means of blood donation，further using ficoll density gradient centrifugation to separate lymphocytes.Trypan blue exclusion and flow cytometry assay were used to detect the cell viability and the changes of CD3+T，CD3+CD8+T and CD3+CD4+T lymphocytes at different time points respectively.The positive rates of HLA-Ⅰ，Ⅱ specific blocking antibodies and the outcome of re-pregnancy were adopted to evaluate the efficacy of cryopreserved lymphocyte active immunotherapy in treatment of RSA.Result：There were no significant differences in lymphocyte survival rate and and cell phenotype stability between fresh day and 7，15，30，60，90 days compared with isolated lymphocytes（P>0.05）.Furthermore，after treatment，the positive rate of blocking antibodies was up to 93.5%.In addition，the probability of successful pregnancy rate was 90.3% in patients with positive blocking antibodies，which was significantly higher than 20.0% in negative patients，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The survival rate and stability of the cells are not changed after autologous plasma cryopreservation，and the method is effect for the treatment of RSA.The lymphocyte derived from voluntary blood donation is safe and reliable，and the patients compliance is good.To some extent，this approach has eased the plight of the source of blood products，and with further clinical use of the value.

【Key words】 Peripheral lymphocytes； Cryopreservation； Recurrent spontaneous abortion； Allogenic immunotherapyendprint

First-authors address：Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Nanjing Medicine University，Nanjing 210004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.006

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）指與同一配偶發(fā)生連續(xù)3次或3次以上的自然流產(chǎn)[1]。RSA病因復(fù)雜，主要包括遺傳因素、子宮解剖異常、感染因素、內(nèi)分泌異常、血栓前狀態(tài)、免疫紊亂等，其中50%～60%與免疫紊亂有關(guān)[2]。免疫性流產(chǎn)分為自身免疫型和同種免疫型。研究發(fā)現(xiàn)，同種免疫型流產(chǎn)的發(fā)生與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）免疫應(yīng)答有關(guān)[3]，臨床表現(xiàn)為RSA患者體內(nèi)封閉抗體（blocing antibodies，BA）不足，即抗丈夫淋巴細(xì)胞抗體（antipaternal lymphocyte antibody，APLA）陽(yáng)性率低[4]，超微結(jié)構(gòu)顯示滋養(yǎng)細(xì)胞淺著床、血管重鑄障礙、滋養(yǎng)細(xì)胞的合體形成不足以及在種植部位有針對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的免疫攻擊現(xiàn)象[5]。

目前，淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療（lymphocyte active immunotherapy，LIT）是針對(duì)以封閉抗體缺乏為主要臨床特征的母胎免疫識(shí)別低下型RSA的重要手段[6-7]。許多研究證實(shí)，LIT可顯著提高RSA患者再次妊娠成功率，并且母兒安全性良好[8-9]。然而，目前淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法淋巴細(xì)胞的制備一般采用反復(fù)多次抽取供血方的外周血，分離獲得淋巴細(xì)胞的方法[10-11]。此法需供血方多次到院抽血，因此依從性差，血液制品的安全性也不能保障。另外，抽取的供血方的外周血，除用于淋巴細(xì)胞提取外，其他血液成分，如紅細(xì)胞、血漿、血小板等均得不到充分利用。為此，本單位與南京紅十字血液中心合作，供血方以無償獻(xiàn)血的方式一次性獻(xiàn)全血400 mL，僅經(jīng)成分分離后的白膜用于淋巴細(xì)胞提取，其他血液成分可同時(shí)用于臨床。獲得的淋巴細(xì)胞經(jīng)自體血漿凍存，深低溫保存，分次復(fù)蘇后供RSA患者免疫治療。本研究通過比較不同時(shí)期凍存淋巴細(xì)胞的存活率和細(xì)胞表型的變化，評(píng)價(jià)凍存淋巴細(xì)胞活性的穩(wěn)定性，通過比較治療前后封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率和再次妊娠成功率，評(píng)價(jià)凍存淋巴細(xì)胞用于RSA治療的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年11月-2016年1月本院中醫(yī)科門診確診的77例RSA患者的臨床資料，所有研究對(duì)象夫婦雙方染色體核型正常，內(nèi)分泌檢查無異常，血常規(guī)、肝腎功能及凝血功能檢測(cè)正常，排除感染性疾病、遺傳疾病和生殖解剖結(jié)構(gòu)異常，抗心磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體篩查陰性，HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體檢測(cè)陰性。77例RSA患者，年齡22～47歲，平均（29.8±4.6）歲，流產(chǎn)次數(shù)2～6次，平均（3.5±0.8）次。所有研究對(duì)象簽署知情同意書，并經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過，自愿接受淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療。

1.2 試劑與儀器 （1）主要試劑。封閉抗體檢測(cè)試劑盒：HLA特異性抗體檢測(cè)試劑盒（美國(guó)萊姆德公司），淋巴細(xì)胞分離液（Axis-Shield），細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（Bioniche Pharme Group Limited），巴士吸管（Biologix），冷凍管（Corning）。（2）儀器：冷凍離心機(jī)（Eppendorf），超低溫冰箱（海爾），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化），流式細(xì)胞儀（BD），氣態(tài)液氮生物容器（金鳳）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴細(xì)胞制備 患者丈夫或無關(guān)第三方以無償獻(xiàn)血的方式一次性獻(xiàn)全血400 mL，全血經(jīng)成分分離后的白膜經(jīng)Ficoll密度梯度離心獲得淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞經(jīng)90%自體血漿+10%細(xì)胞冷凍保護(hù)劑重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至（2～4）×107個(gè)/mL，程序降溫凍存后置于液氮中保存，復(fù)蘇后使用。

1.3.2 不同時(shí)期凍存淋巴細(xì)胞活性測(cè)定 取新鮮分離及凍存后7、15、30、60、90 d淋巴細(xì)胞懸液加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液10 μL，加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率。活細(xì)胞百分率=（活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%

1.3.3 不同時(shí)期凍存淋巴細(xì)胞穩(wěn)定性測(cè)定 分別在淋巴細(xì)胞凍存前，凍存后7、15、30、60、90 d流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞和CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比，比較不同時(shí)期凍存淋巴細(xì)胞活性的穩(wěn)定性。

1.3.4 免疫方法 復(fù)蘇后的淋巴細(xì)胞給予患者前臂內(nèi)側(cè)多點(diǎn)皮下注射。4次為一療程，每次間隔2周，1個(gè)療程后復(fù)查封閉抗體。若轉(zhuǎn)陽(yáng)，可考慮妊娠，孕后加強(qiáng)注射3～4次，每次間隔3～4周，直至孕12周。若轉(zhuǎn)陽(yáng)后，仍未能妊娠，每隔6～8周加強(qiáng)注射1次。若未轉(zhuǎn)陽(yáng)，繼續(xù)一療程免疫治療后考慮妊娠。

1.3.5 封閉抗體檢測(cè) ELISA法檢測(cè)患者外周血HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體滴度，具體操作按照HLA特異性抗體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率比較 第一療程最后一次淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療結(jié)束后一周，抽取患者外周血，用封閉抗體EILSA檢測(cè)試劑盒測(cè)定HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體，計(jì)算淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后第一療程封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率。第一療程未轉(zhuǎn)陽(yáng)患者，繼續(xù)予以第二療程淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療，并于第二療程最后一次治療結(jié)束后一周抽取外周血，測(cè)定HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體，計(jì)算第二療程封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率和累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率。

1.4.2 再次妊娠成功率比較 將妊娠≥14周且B超檢查未見異常視為妊娠成功。計(jì)算各組再次妊娠成功率，以其作為療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。隨訪RSA患者再次妊娠、胎兒發(fā)育以及流產(chǎn)情況。endprint

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期自體血漿凍存淋巴細(xì)胞存活率比較 淋巴細(xì)胞經(jīng)自體血漿凍存，氣態(tài)液氮保存，在凍存7、15、30、60、90 d后復(fù)蘇，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察活細(xì)胞均形態(tài)完整，細(xì)胞存活率分別為（86.67±0.21）%、（86.89±0.54）%、（85.58±0.59）%、（84.98±0.41）%、（85.03±0.33）%，不同時(shí)期凍存淋巴細(xì)胞與新鮮分離淋巴細(xì)胞存活率（87.31±0.48）%比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 不同時(shí)期凍存淋巴細(xì)胞免疫表型變化比較 自體血漿凍存，氣態(tài)液氮低溫保存的淋巴細(xì)胞，在0～90 d內(nèi)CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞和CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞百分比雖逐漸下降，但與凍存前比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.3 凍存淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率比較 77例接受凍存淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的RSA患者，第一療程結(jié)束后55例HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，第一療程轉(zhuǎn)陽(yáng)率為71.4%；第二療程結(jié)束后17例HLA-Ⅰ、Ⅱ類特異性抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，第二療程轉(zhuǎn)陽(yáng)率為77.3%，累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率為93.5%，見表2。

2.4 凍存淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后封閉抗體陽(yáng)性與陰性者再次妊娠成功率比較 77例接受凍存淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的RSA患者再次妊娠后66例妊娠>14周，11例患者再次妊娠丟失，再次妊娠成功率為85.7%。其中封閉抗體陽(yáng)性者再次妊娠成功率為90.3%，陰性者為20.0%，封閉抗體陽(yáng)性者再次妊娠成功率顯著高于陰性者，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3 討論

研究表明，孕婦血中的APLA可中和同種異體抗原，而不使胎兒受到排斥，還可直接結(jié)合到靶細(xì)胞的抗原上，降低它們對(duì)受體細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的敏感性[12-14]。APLA產(chǎn)生不足，母體對(duì)胎兒產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥現(xiàn)象，發(fā)生于孕早期可出現(xiàn)反復(fù)自然流產(chǎn)，孕晚期則可發(fā)生妊娠期高血壓疾病、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，甚至胎死宮內(nèi)[15-16]。

目前，針對(duì)APLA缺乏復(fù)型RSA仍主要采用丈夫或無關(guān)第三方的外周血淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫療法[17]。循證醫(yī)學(xué)研究表明，經(jīng)淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療后，APLA陽(yáng)性率明顯高于治療前，再次妊娠成功率達(dá)72.73%～86.20%，其中APLA陽(yáng)性者再次妊娠的成功率明顯高于陰性者，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)母、兒的副反應(yīng)[18-20]。

本研究結(jié)果表明，經(jīng)自體血漿凍存的淋巴細(xì)胞在凍存3個(gè)月時(shí)存活率仍達(dá)85%左右，與新鮮分離淋巴細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），并且細(xì)胞免疫表型穩(wěn)定。回顧性分析2014年11月-2016年1月完成1～2療程淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療的77例RSA再次妊娠患者的臨床資料，結(jié)果顯示：經(jīng)自體血漿凍存淋巴細(xì)胞免疫治療后，HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ類特異性抗體累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率，即封閉抗體累計(jì)轉(zhuǎn)陽(yáng)率為93.5%，再次妊娠成功率（以妊娠>14周計(jì)算）為85.7%。

綜上所述，與傳統(tǒng)淋巴細(xì)胞制備方法比較，本法獲得的淋巴細(xì)胞來源于血站，嚴(yán)格按照血液制品使用規(guī)范采集，安全性高，供血方無需多次抽血，依從性好。并且，供血方所獻(xiàn)全血的其他成分也能得到充分利用。另本法獲得的淋巴細(xì)胞經(jīng)自體血漿凍存后不影響細(xì)胞存活率和封閉抗體的轉(zhuǎn)陽(yáng)率，對(duì)RSA患者淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療效果明確，且可一定程度緩解臨床血液制品來源困難的處境，具有進(jìn)一步臨床推廣使用的價(jià)值。

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（收稿日期：2017-08-04） （本文編輯：程旭然）endprint