金四華，楊 磊，何婷婷，范心鳳，藺和太，劉 平，耿照玉*

（1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2. 青陽縣平云牧業(yè)開發(fā)有限公司，安徽池州 242800）

雞是第1個完成全基因組測序的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物[1]，隨后鴨[2]、鵝[3]、火雞[4]、鴿子[5]等禽類的參考基因組拼接和組裝工作相繼完成，高質(zhì)量的基因組序列信息促進(jìn)了家禽功能基因組和結(jié)構(gòu)基因組的發(fā)展與完善，進(jìn)一步豐富了家禽基因組信息，大量遺傳變異的挖掘和鑒定為解析家禽表型多樣性、基因組進(jìn)化以及抗病育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

基因組遺傳變異是生物體的基本特征，根據(jù)其存在形式主要分為4種類型，包括單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、2～50 bp的小片段的插入或缺失（Insertion or Deletion，InDel）、50 bp以上的拷貝數(shù)變異（Copy Number Variations，CNVs）以及由位置變化引起的易位或倒位（Translocation or Inversion）[6]。這些數(shù)量眾多、形式多樣的遺傳變異造成畜禽外貌特征、生產(chǎn)性能、經(jīng)濟(jì)用途以及抗病性等的差異。

SNP由于數(shù)量最多、分布廣泛、遺傳穩(wěn)定且容易分型等多種優(yōu)點(diǎn)，成為研究畜禽外貌特征、生產(chǎn)性能以及疾病抗性與易感性的重要分子標(biāo)記。但基因組中存在一些稀有SNP、上位效應(yīng)和連鎖關(guān)系等，限制了SNP的精細(xì)定位及育種應(yīng)用。與SNP相比，CNVs為大片段的結(jié)構(gòu)變異，能夠影響畜禽基因組中較大的區(qū)域，甚至引起特定基因序列和表達(dá)的變化。目前，CNVs已經(jīng)在人[7]、果蠅[8]、小鼠[9]、牛[10]、雞[11]等動物中得到廣泛地關(guān)注和研究。

本文對CNVs研究歷程及檢測方法進(jìn)行綜述，重點(diǎn)討論存在問題及CNVs對家禽表型的影響，并對CNVs在家禽抗病育種中的應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 CNVs概述

1.1 CNVs研究歷程 早在1936年，Bridges等[12]研究果蠅榜眼時發(fā)現(xiàn)染色體上片段發(fā)生重復(fù)，棒眼顯性突變Bar基因2個或多個串聯(lián)重復(fù)會引起突變體果蠅單眼數(shù)變少，導(dǎo)致復(fù)眼的形成，但在當(dāng)時并未引起足夠的重視。2004年，Iafrate等[13]和Sebat等[14]對正常人群基因組變異進(jìn)行大規(guī)模篩查，發(fā)現(xiàn)人類基因組中廣泛存在大小從1 kb到Mb范圍內(nèi)的拷貝數(shù)變異現(xiàn)象，包括DNA片段的插入、缺失、重復(fù)以及衍生出的染色體微結(jié)構(gòu)變異，從此揭開CNVs研究的序幕和熱潮。

CNVs具有4個主要特征：首先，CNVs覆蓋度高。CNVs數(shù)量雖然少，但大部分CNVs長度較長，基因組中覆蓋堿基數(shù)比SNP多[15]。其次，CNVs在基因組中分布不均勻。CNVs在基因組中存在其突變熱點(diǎn)區(qū)域，CNVs主要分布于著絲粒、亞端粒區(qū)和異染色質(zhì)等進(jìn)化不穩(wěn)定的區(qū)域。第三，CNVs多態(tài)可能影響基因表達(dá)水平，最終對基因外顯率產(chǎn)生影響。最后，CNVs具有較高突變率[16]。人類基因組中，CNVs每個世代的突變率為 1.7×10-6～1.0×10-4，遠(yuǎn)高于 SNP 突變率。隨著測序技術(shù)快速發(fā)展以及生物信息分析方法的精細(xì)化，McDonald等[6]將CNVs定義為與參考序列相比，基因組中長度大于50 bp DNA片段的插入、缺失或重復(fù)等。另外，CNVs在人類和很多模式生物中得到廣泛和深入地研究，并鑒定很多有功能的CNVs[17]。因此，CNVs作為畜禽基因組中一種重要遺傳變異，將有助于更好地解析表型發(fā)生、疾病抗性與易感性及其進(jìn)化的遺傳機(jī)制，最終應(yīng)用于畜禽的分子育種中。

1.2 CNVs檢測方法 隨著高通量測序技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，解析畜禽表型形成和疾病發(fā)生的分子遺傳機(jī)制成為動物分子育種的關(guān)鍵，如何快速、準(zhǔn)確、高效地在畜禽基因組中鑒定和驗(yàn)證具有功能性的CNVs成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。

目前全基因組范圍內(nèi)檢測CNVs的方法主要包括比較基因組雜交技術(shù)（Array-Based Comparative Genome Hybridization，aCGH）、SNP芯片技術(shù)和全基因組重測序技術(shù)。aCGH芯片技術(shù)是檢測CNVs常用的方法，具有準(zhǔn)確性高、靈敏、分辨率高、成本低等特點(diǎn)，但是其分辨率受限于固化在芯片上探針的長度和數(shù)目[18]。SNP芯片是另外一種廣泛使用且高效的CNVs檢測平臺，該方法通量高、操作簡單便捷、成本低，同時不需要參考樣本及實(shí)驗(yàn)群體的雜交，能夠進(jìn)行不同組間的比較[19]，但該方法信噪比較低，容易出現(xiàn)假陽性，同時對于基因組比較復(fù)雜的區(qū)域以及高度重復(fù)區(qū)域難以設(shè)計(jì)理想的探針，目前一般采用aCGH和SNP芯片技術(shù)混合使用，以提高檢測效率[20]。目前，高通量測序技術(shù)檢測CNVs成為研究的熱點(diǎn)和有效方法，該方法理論上能夠檢測基因組中所有CNVs變異類型，分辨率高、檢測速度快、準(zhǔn)確性高[21-22]，但該方法受限于參考基因組組裝完整性及分析平臺的數(shù)據(jù)負(fù)荷。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，該方法對檢測基因組中CNVs具有廣闊的發(fā)展前景。

對于已發(fā)現(xiàn)的CNVs需要進(jìn)一步篩選、鑒定和驗(yàn)證，以找到引起畜禽表型差異的靶標(biāo)CNVs。目前驗(yàn)證方法主要包括定量PCR和基于雜交的熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescencein situHybridization，F(xiàn)ISH）[23]。其中，定量PCR因操作簡單、速度快、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。

2 CNVs對家禽表型的影響

家禽不僅是一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物，也是分子遺傳學(xué)和基礎(chǔ)生物學(xué)的重要模式生物，對其基因組CNVs進(jìn)行深入挖掘和驗(yàn)證，有助于將其作為一種廉價高效的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于未來家禽的選育和育種規(guī)劃中。

迄今為止，科研人員已經(jīng)在家禽基因組中挖掘和鑒定出一些與家禽表型變異密切相關(guān)的CNVs。Griffin等[24]通過染色體涂染和aCGH芯片技術(shù)構(gòu)建雞和火雞精細(xì)的比較細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜，獲得16個品種間的CNVs，并通過分析發(fā)現(xiàn)禽類的基因組在進(jìn)化過程相對保守。雞的快慢羽是家禽特有的一種重要特征，是雛禽雌雄自別的一種重要手段，其由性染色體Z上的K基因所決定，在家禽生產(chǎn)中具有重要的實(shí)用價值。Elferink等[25]在研究快慢羽產(chǎn)生機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，慢羽性狀是由K基因座上一段含有PRLR和SPEF2基因的串聯(lián)重復(fù)序列引起的，慢羽表型與該CNVs顯著關(guān)聯(lián)。雞的豆冠是雞品種中一種重要的外貌特征，其由顯性基因控制。豆冠表型引起雞冠和肉垂大大減少，可以減少雞熱量的損失并降低凍傷的易感性。Wright等[26]研究報道，雞的豆冠是由SOX5基因第1內(nèi)含子內(nèi)一段保守的非編碼序列拷貝數(shù)的增加引起的，該表型是雞在寒冷環(huán)境下的一種適應(yīng)性性狀。Skinner等[27]采用熒光原位雜交技術(shù)對雞和北京鴨進(jìn)行比較基因組分析，結(jié)果表明北京鴨基因組中存在32個潛在的CNVs，其中5個CNVs共存在于火雞與雞的CNVs熱點(diǎn)區(qū)域。Wang等[28]對白來航、洛島紅雞和科尼什肉雞等品種CNVs進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)96個CNVs，且該片段包含鋅指蛋白基因和醛糖還原酶基因。絲羽烏骨雞的烏皮烏骨表型主要是由真皮黑色素過度沉積引起。Dorshorst等[29]報道，雞20號染色體上2個CNVs區(qū)域形成1個重組結(jié)構(gòu)，第1個CNVs區(qū)域的EDN3基因被鎖定為引起黑色素沉積的目標(biāo)基因。Gunnarsson等[30]研究表明，SOX10基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游8.3 kb的片段缺失引起雞深棕色羽色的發(fā)生。Jia等[11]采用高密度SNP芯片篩選白來航蛋雞和矮小褐殼蛋雞的CNVs，發(fā)現(xiàn)209個CNVRs，覆蓋1.42%基因組，為雞CNVs進(jìn)一步研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。Yi等[21]采用全基因組重測序技術(shù)對12只不同類型的雞進(jìn)行CNVs分析，發(fā)現(xiàn)8 840個CNVRs，總長度為98.2 Mb，占基因組的9.4%，并采用aCGH芯片驗(yàn)證測序結(jié)果[20]；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SOCS2基因的CNVs可能與斗雞骨密度密切相關(guān)[31]。

前期研究表明，CNVs可通過改變基因劑量或干擾基因活性影響基因表達(dá)與表型差異[32-33]，進(jìn)而引起疾病發(fā)生。近年來，研究者對CNVs與家禽疾病的易感性或抗病性進(jìn)行了相關(guān)研究。Luo等[34]首次在全基因組范圍內(nèi)檢測到2個高度近交的抗病系和易感系中馬立克氏病易感性與CNVs的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)2個與馬立克氏病抗性顯著相關(guān)的CNVs。Yan等[35]采用全基因組重測序技術(shù)對馬立克氏病抗性相差較大的2個品系進(jìn)行研究，抗性和易感系分別檢測到1 546個和1 866個特異性CNVRs，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)67個品系特有的CNVRs以及62個馬立克氏病易感性關(guān)聯(lián)的基因。該報道為深入研究馬立克氏病提供新的遺傳標(biāo)記和新的視角。Xu等[36]采用600 K高密度SNP芯片對63系、72系以及近交重組系RCS進(jìn)行CNVs分析，發(fā)現(xiàn)393個CNVs區(qū)域，其中12個CNVs是易感品系72特有的，并且2個缺失型CNVs影響臨近基因的表達(dá)。上述研究結(jié)果表明，CNVs與家禽表型特征和疾病相關(guān)的性狀密切相關(guān)，進(jìn)一步研究CNVs的形成機(jī)理、作用機(jī)制以及在家禽分子育種中的應(yīng)用具有重要的意義。

3 CNVs研究存在的問題

目前畜禽CNVs處于快速發(fā)展階段，多種畜禽的CNVs圖譜已經(jīng)構(gòu)建并取得初步進(jìn)展，但仍然存在一些問題。

家禽功能基因組學(xué)的核心問題是闡述家禽表型和疾病產(chǎn)生的致因突變及遺傳機(jī)制[37]。因此，進(jìn)行畜禽遺傳改良的前提是尋找并驗(yàn)證基因組中重要的遺傳變異，CNVs作為基因組中廣泛存在的遺傳變異類型，準(zhǔn)確、高效地鑒定基因組中CNVs是研究者和育種者亟待解決的熱點(diǎn)問題。但是，前期多項(xiàng)研究表明CNVs檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性不高，因此需要進(jìn)一步完善家禽參考基因組組裝，CNVs檢測方法完善和研究策略開發(fā)也至關(guān)重要。目前檢測CNVs的方法主要有SNP芯片和基因組重測序技術(shù)。SNP芯片檢測一方面受到探針密度的影響，同時基因組中一些較為復(fù)雜結(jié)構(gòu)區(qū)域或片段高度重復(fù)區(qū)域，設(shè)計(jì)探針較困難因而CNVs的檢測數(shù)量有限。另外，一些較短的CNVs以及CNVs的絕對拷貝數(shù)檢測不到[20]?；蚪M重測序技術(shù)可以克服SNP芯片檢測存在的問題，但目前測序成本較高，不利于在大規(guī)模群體中開展研究。

近年來，新開發(fā)的第3代測序技術(shù)得到快速發(fā)展，其測序讀長較長，并且對基因組中復(fù)雜結(jié)構(gòu)或區(qū)域具有較高的分辨率，可以提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度[38]。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展以及測序成本大幅度降低，基因組更多CNVs將被挖掘和驗(yàn)證。同時，分析軟件和算法的進(jìn)一步完善，也將有助于提高CNVs檢測效率和準(zhǔn)確度[39]。另外，檢測基因組已知CNVs區(qū)域的變異類型、芯片技術(shù)更具有優(yōu)勢，將有助于育種企業(yè)的應(yīng)用。此外，目前多數(shù)研究主要集中于找到基因組中存在CNVs，而對CNVs的形成機(jī)理、作用機(jī)制以及功能的研究不夠深入，CNVs與畜禽表型多樣性以及復(fù)雜疾病的形成機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 CNVs在家禽抗病育種中的應(yīng)用展望

疾病是限制現(xiàn)代家禽生產(chǎn)發(fā)展的一個重要因素，雖然目前采用疫苗接種和藥物進(jìn)行預(yù)防，但是未能從根本上阻斷疾病的發(fā)生和流行。對家禽抗病性狀的研究和育種實(shí)踐表明，采用遺傳策略從本質(zhì)上改善家禽對疾病的抗性，提高其免疫機(jī)能，進(jìn)行分子抗病育種具有重要的意義。

家禽遺傳抗性研究一直以來是家禽研究者和育種者關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的育種一般為表型選育，根據(jù)表型挑選抗病力強(qiáng)的個體留為種用，這種選擇方法周期較長、成本高、選育效率低下，育種效率低，難于取得預(yù)期的效果[40]。分子育種具有周期短、不受環(huán)境和性別及年齡等限制、準(zhǔn)確性高、效率高、能夠進(jìn)行早期選擇等優(yōu)點(diǎn)[41]，受到研究者和生產(chǎn)者的廣泛關(guān)注。家禽抗病育種工作的核心任務(wù)就是對家禽進(jìn)行選育與改良，尋找和挖掘影響家禽抗病性并能夠穩(wěn)定遺傳的分子輔助標(biāo)記[42]。CNVs作為家禽基因組中一種廣泛存在的遺傳變異，揭示其與疾病抗性和易感性的密切聯(lián)系，將為家禽抗病育種提供有效的遺傳標(biāo)記信息。例如，可以采用qPCR或SNP芯片檢測對照組和處理組在基因組中CNVs差異，將差異的CNVs與疾病進(jìn)行進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析，最終將該CNVs作為該疾病的潛在分子標(biāo)記。同時，遺傳選育時可以鑒定能夠用于區(qū)分疾病抗性或易感性的特定基因型或單倍型，從而達(dá)到培育適應(yīng)性強(qiáng)、抗病的家禽品種或品系。另外，我國地方家禽遺傳資源豐富，適應(yīng)性好、抗病力強(qiáng)，根據(jù)這些特征和優(yōu)勢，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的SNP芯片（如由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所和北京康普森生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研發(fā)的蛋雞55 K SNP芯片和肉雞55 K SNP芯片），將有助于挖掘和鑒定相關(guān)性狀的功能CNVs，可進(jìn)一步豐富我國家禽遺傳變異信息。此外，CNVs為研究疾病的致病機(jī)理、預(yù)防疾病的發(fā)生以及藥物的研發(fā)提供新思路和途徑。

近年來，基因組編輯技術(shù)得到快速發(fā)展，特別是以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為核心的第3代基因組編輯技術(shù)，近年來經(jīng)過人工改造后成為一種操作簡單、高效和適用范圍廣的基因打靶技術(shù)，能夠在基因組水平上對變異類型進(jìn)行精確修飾[43]。該技術(shù)在基因組編輯中，未引入新的基因，安全性較高，目前在家禽育種已經(jīng)得到應(yīng)用[44]。另外，隨著基因組測序技術(shù)和新算法的開發(fā)，多種與家禽疾病抗性和易感性相關(guān)的CNVs被發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證。同時，家禽基因編輯技術(shù)與測序技術(shù)聯(lián)合使用將會促進(jìn)家禽抗病育種的快速發(fā)展和不斷完善，提供更多高效而且安全的標(biāo)記應(yīng)用于家禽抗病育種中。綜上可知，未來家禽抗病育種將集現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)之大成，CNVs將作為一種重要的遺傳標(biāo)記或遺傳信息應(yīng)用于家禽的分子抗病育種之中。

5 結(jié) 語

隨著具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因芯片的研發(fā)，高通量測序技術(shù)以及基因組編輯技術(shù)的快速發(fā)展，家禽基因組內(nèi)大量的CNVs將被挖掘，并篩選和驗(yàn)證出一些與家禽表型特征、重要經(jīng)濟(jì)性狀以及疾病抗性密切相關(guān)的CNVs。因此，CNVs作為一種重要的遺傳變異，為家禽遺傳資源的保護(hù)和開發(fā)、完善和優(yōu)化家禽育種策略以及加快遺傳進(jìn)展等方面奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為從全基因組范圍內(nèi)挑選適應(yīng)性強(qiáng)、生產(chǎn)性能優(yōu)秀、抗性強(qiáng)（耐寒、抗熱或抗?。┑姆N用家禽，以及進(jìn)行家禽相關(guān)性狀的早期選擇和分子抗病育種提供新的思路和途徑，未來將作為一種重要且有效的分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于家禽的選育與育種工作中。與此同時，將新挖掘和驗(yàn)證的CNVs與SNP進(jìn)行整合和利用，將為揭示家禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳機(jī)理、家禽基因組進(jìn)化機(jī)制以及復(fù)雜疾病的致病機(jī)理提供有效的方法。因此，CNVs將廣泛應(yīng)用于家禽選育與分子抗病育種工作之中，并具有重要的研究意義和廣闊的應(yīng)用前景。

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