張瑩輝，姚文生，康 凱，王團(tuán)結(jié)，薛 麒，吳思捷，趙俊杰，印春生

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

山羊痘病毒(goat pox virus，GTPV)屬于痘病毒科(poxviridae)脊椎動(dòng)物痘病毒亞科(poxvirinae)山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)，可感染綿羊和山羊引起惡性痘病，包括肯尼亞綿羊痘、山羊痘、印度羊皮炎、北非綿羊和山羊的石痘等，其中細(xì)毛羊、羔羊最易感山羊痘病毒。病羊呈現(xiàn)特征性的臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發(fā)生丘疹和皰疹、淋巴結(jié)腫大、皮膚水腫、病羊消瘦、產(chǎn)乳量大幅度降低，嚴(yán)重降低了山羊的生產(chǎn)性能及羊毛和羊皮制品的質(zhì)量，是所有動(dòng)物痘病中最為嚴(yán)重的一種，成年發(fā)病羊死亡率可高達(dá)42.06%，病羔羊死亡率高達(dá)100%，一旦發(fā)病可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。本病在世界許多地區(qū)已有發(fā)生，特別是非洲北部、中東和亞洲的部分國家流行較為嚴(yán)重，我國周邊國家如尼泊爾、俄羅斯、印度等也均有流行。而我國境內(nèi)的江蘇、陜西、福建以及四川、云南、廣西等地也有該病的發(fā)生，主要是由于養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展過程中，品種的引進(jìn)、流動(dòng)引起了山羊痘的傳播和流行。此病為OIE規(guī)定的A類疾病，我國將其列為國家I類動(dòng)物疫病[4-6]。此外山羊痘病毒還可感染人，重慶市彭水縣發(fā)生一例具有特異性病原學(xué)診斷依據(jù)人感染羊痘病例，其他地區(qū)還發(fā)生過幾例人感染羊痘的報(bào)道，所有病例均有與病羊的接觸史，為接觸性感染，因此山羊痘病毒檢測方法的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[7]。為此，就近年來山羊痘病毒檢測方法研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以為其確診提供參考。

1　病原學(xué)檢測

1.1病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定可采集發(fā)病羊皮膚和黏膜的痘疹和痘斑以及鼻腔分泌物、發(fā)熱期血液和肺部病變組織、淋巴結(jié)等作為病料[8]。山羊痘病毒培養(yǎng)多選用原代或次代羔羊睪丸細(xì)胞或羔羊腎細(xì)胞，除這兩種細(xì)胞較為敏感外，犢牛睪丸細(xì)胞也具有同樣的敏感性，一些分離株也可在Vero、BHK-21及雞胚絨毛尿囊膜細(xì)胞上生長。

劉棋等[9]使用疑似病羊的皮膚丘疹、水泡或膿皰組織的病毒懸液接種于初生羔羊睪丸細(xì)胞觀察到明顯的細(xì)胞病變：接種第2天大部分細(xì)胞變圓、變細(xì)，細(xì)胞漿內(nèi)有可疑顆粒及空泡，感染單層細(xì)胞在5天內(nèi)死亡；而接種于9～10日齡雞胚絨毛尿囊膜，未見痘斑，傳3代均無異常變化。切環(huán)[10]取內(nèi)蒙古病羊的皮膚痘疹和水皰作病料樣品，分別接種BHK-21傳代細(xì)胞和10日齡SPF雞胚，BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的、規(guī)律的細(xì)胞病變：單層BHK-21細(xì)胞在24 h后開始收縮、聚集，于48 h后病變細(xì)胞開始拉網(wǎng)，出現(xiàn)空泡，至72 h細(xì)胞全部脫落死亡。接種病料樣品的10日齡SPF雞胚，在120 h后剖檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞胚胚體出血、充血，絨毛尿囊膜增厚，接種部位具有明顯的痘斑。周碧君等[11]取貴州省發(fā)生的疑似山羊痘病例山羊的皮膚皰疹和水疤作病料，接種BHK-21傳代細(xì)胞盲傳3代后，出現(xiàn)了明顯的、規(guī)律的細(xì)胞病變。用該BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物接種9日齡雞胚絨毛尿囊膜，隨著傳代次數(shù)的增加，痘斑病變的出現(xiàn)率有所上升。李有文等[12]將某制藥廠提供的山羊痘病毒毒株接種于經(jīng)過三種不同處理的綿羊睪丸細(xì)胞，出現(xiàn)了不同的細(xì)胞病變，其中接種于原代綿羊睪丸細(xì)胞，在病變初期細(xì)胞圓縮或變長，中期成片成葡萄串狀，后期為長梭細(xì)胞與葡萄串狀交織相連；而接種于傳代綿羊睪丸細(xì)胞，病變初期細(xì)胞變長，中期細(xì)胞交織拉網(wǎng)，后期細(xì)胞間質(zhì)變大、脫落；接種于凍存的綿羊睪丸細(xì)胞，細(xì)胞在病變初期變窄、變長，中期長細(xì)胞交織拉網(wǎng)，后期細(xì)胞間質(zhì)變大、脫落。

1.2病毒的電鏡觀察周碧君等[4]采集了貴州兩個(gè)山羊痘疫區(qū)的病死羊病料，經(jīng)過雞胚絨毛尿囊膜細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)，將培養(yǎng)所得材料制成切片，經(jīng)硝酸鉛和醋酸鉛雙重染色后對(duì)病毒粒子進(jìn)行了觀察：初期的病毒粒子呈卵圓形，大小約為250 nm～350 nm，被膜完整或不完整，被膜內(nèi)所含電子密度較高而均勻的物質(zhì)所占比例大，另有電子密度中等而均勻的物質(zhì)分布在電子密度較高物質(zhì)的四周；中期的病毒粒子形狀和大小類似于初期病毒，但電子密度高的物質(zhì)所占比例較小，病毒粒子直徑較小，可見致密的類核體；完全成熟的病毒粒子致密，多呈卵圓形，電子密度不均勻，大小約為(150 nm～180 nm)×(220 nm～280 nm)，中央有呈啞鈴形的核酸芯髓和兩個(gè)功能不清的側(cè)小體。

2　血清學(xué)檢測方法

2.1病毒中和試驗(yàn)病毒中和試驗(yàn)是檢測羊痘病毒特異性較強(qiáng)的血清學(xué)診斷方法，但羊痘感染后主要以細(xì)胞免疫為主，感染動(dòng)物僅產(chǎn)生低水平的中和抗體，導(dǎo)致病毒中和試驗(yàn)的敏感性不高[13-14]。

2.2免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)周碧君等[11]將盲傳4代后感染BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次與山羊痘標(biāo)準(zhǔn)陽性血清做瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，能夠出現(xiàn)白色沉淀線，而與正常對(duì)照細(xì)胞沉淀抗原和PBS不出現(xiàn)沉淀線。王開功等[15]采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)患病山羊皮膚黏膜痘疹和感染細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)對(duì)于病毒粒子含量較高的病料，其陽性檢出率亦較低，對(duì)感染細(xì)胞培養(yǎng)物也難以直接檢出病毒抗原。

2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)王芳等[16]將人工合成密碼子優(yōu)化的GPV p32基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，以純化的重組p32-opti蛋白作為ELISA包被抗原，建立了間接ELISA抗體檢測方法。該ELISA檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性，可用于GPV感染的流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗接種動(dòng)物的抗體水平監(jiān)測。

2.4免疫熒光抗體試驗(yàn)劉忠偉等[8]使用異硫氰酸熒光標(biāo)記兔抗羊痘IgG，并以羊痘熒光抗體檢測羊痘皮膚痘疹切片和感染細(xì)胞抹片，發(fā)現(xiàn)了特異性黃綠色熒光。徐春志等[17]制備了山羊痘直接熒光抗體，檢測感染細(xì)胞中的山羊痘病毒抗原，可檢測出BHK-21感染細(xì)胞中病毒抗體原，且此熒光能夠被山羊痘標(biāo)準(zhǔn)陽性血清特異性抑制，用制備的熒光抗體檢測感染山羊痘病毒標(biāo)準(zhǔn)弱毒株、疫苗株及分離株的BHK-21細(xì)胞抹片，結(jié)果均為陽性，檢測正常細(xì)胞為陰性。

2.5血凝試驗(yàn)王開功等[18]采用兔抗山羊痘病毒IgG致敏綿羊紅細(xì)胞建立的反向間接血凝試驗(yàn)，對(duì)山羊痘病毒抗原有較高特異性和敏感性，與其它動(dòng)物疾病病毒抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)。對(duì)現(xiàn)場采集的山羊痘待檢抗原的檢測結(jié)果表明其敏感性比AGP高，該反向間接血凝試劑可應(yīng)用于獸醫(yī)臨床診斷(血清學(xué)監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查)也可作為山羊痘病毒分離培養(yǎng)的血清學(xué)檢測指標(biāo)，是一種靈敏、簡單、快速的診斷方法。

3　分子生物學(xué)檢測方法

3.1PCR檢測方法PCR又叫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是體外酶促合成特異性DNA的一種方法，它能夠使目的DNA迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等特點(diǎn)，可用于基因分離、克隆及核酸序列分析等研究。山羊痘病毒屬于雙股DNA病毒，更適于PCR檢測[19]。徐春志等[17]比較了Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后，根據(jù)山羊痘病毒P32基因設(shè)計(jì)了引物，建立了可用于山羊痘臨床診斷的特異性強(qiáng)、可靠性好、靈敏度高的PCR方法，該方法可檢測出山羊痘病毒Y株、貴州現(xiàn)場分離毒LD株和QL株的細(xì)胞感染物以及山羊痘疹樣本中病毒DNA。張志成等[20]基于GenBank上發(fā)表的羊痘病毒全基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物，建立了檢測羊痘病毒的PCR方法及其試劑盒。郭巍等[19]人基于山羊痘病毒P32特異性基因和α-微管蛋白特異性基因，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，擴(kuò)增到了P32基因與GenBank上收錄序列同源性達(dá)到98%，表明了該方法具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。

3.2PCR-酶切檢測方法馮迎春等[21]針對(duì)山羊痘病毒T3A/T3C基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異引物，并以其DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接到pMD18載體進(jìn)行序列測定，其結(jié)果與已報(bào)道的山羊痘病毒相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性高達(dá)98%。同時(shí)利用產(chǎn)物中的特有酶切位點(diǎn)EcpR V(89位)進(jìn)行進(jìn)一步的酶切分析，建立了特異的PCR/酶切檢測方法，結(jié)果表明該引物特異性好，敏感性強(qiáng)，可應(yīng)用于山羊痘病毒感染的臨床診斷。

3.3熒光定量PCR檢測方法熒光定量PCR是20世紀(jì)90年代由美國某生物公司率先推出的一種新型的核算定量技術(shù)，相比普通PCR，它具有較強(qiáng)的直觀性，特異性強(qiáng)、敏感性好、精確性高，從而被廣泛用于疾病診斷、基因檢測和免疫分析等領(lǐng)域[22-23]。張倩等[24]針對(duì)山羊痘病毒基因組P32基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，構(gòu)建出穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，來替代定量測定山羊痘疫苗半成品中的核酸。該標(biāo)準(zhǔn)品敏感性和特異性高、穩(wěn)定性好，可用于山羊痘核酸的定量測定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)施監(jiān)測PCR的全過程，最后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板進(jìn)行定量分析[25]，是一種靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的PCR方法，可廣泛用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究[26]。目前在獸醫(yī)領(lǐng)域，RQ-PCR應(yīng)用于病原體分子檢測、基因表達(dá)定量分析、單核苷酸多態(tài)性及其突變分析等[27]。安維雪等[28]針對(duì)山羊痘病毒參考毒株A29L基因序列,設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物以及2條TaqMan探針,同時(shí)制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立了羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法,該診斷方法與4種非羊痘病毒不發(fā)生交叉反應(yīng),其重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均低于2%，具有良好的特異性,靈敏性、穩(wěn)定性。姚俊等[29]針對(duì)山羊痘病毒gp063基因DNA序列，設(shè)計(jì)了1條PCR引物和1支TaqMan探針，同時(shí)制備了含有靶DNA序列的PEASY-T1重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了山羊痘病毒Taqman法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，經(jīng)檢測該方法具有較高的靈敏性、特異性且安全、快速，適用于山羊痘病毒的早期檢測。趙文華等[30]基于小反芻獸疫病毒的N基因以及山羊痘病毒的ITR基因，分別設(shè)計(jì)合成了2套特異性引物及探針，分別用5’FAM-TAMRA3’及5’JOE-Eclipse3’標(biāo)記后建立了N-ITR基因的二聯(lián)探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，該方法特異性好，敏感度高，無交叉反應(yīng)，且可實(shí)現(xiàn)兩種病毒的快速同步檢測。程振濤等[31]選取了位于山羊痘病毒基因組gp064區(qū)域的基因片段，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)PCR引物和一條TapMan-MGB探針，建立了PQ-PCR和標(biāo)準(zhǔn)曲線，該檢測方法可用于臨床樣本、人工感染動(dòng)物試驗(yàn)組織以及三帶喙庫蚊體內(nèi)山羊痘病毒的定量檢測，特異性高、敏感性好、臨床應(yīng)用性強(qiáng)。

3.4雙重PCR檢測方法在PCR技術(shù)不斷發(fā)展過程中，產(chǎn)生了多重PCR技術(shù)，能夠一次性鑒別多種疾病，在疫病的診斷上有著非常大的優(yōu)勢[32]。向智龍等[33]基于山羊痘病毒ITR和羊口瘡病毒H2L基因片段，合成兩對(duì)引物，以山羊痘病毒和羊痘瘡病毒的核酸混合物作為模板，建立了快速鑒別檢測兩種病毒的雙重PCR方法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、快速簡便，可用于山羊痘病毒和羊口瘡病毒的聯(lián)合檢測和鑒別診斷。肖雯等[34]針對(duì)綿羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒的基因組序列，分別設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，經(jīng)優(yōu)化條件，建立了快速鑒別檢測SPPV和GTPV的雙重PCR方法，該方法特異性試驗(yàn)中，未對(duì)牛疙瘩皮膚病病毒、犬細(xì)小病毒、大腸桿菌O157、沙門氏菌等有特異性擴(kuò)增，同時(shí)具有較好的靈敏度。

4　存在的問題與展望

綜上所述，要防治山羊痘的發(fā)生和流行，其早期的診斷非常重要。在山羊痘病毒的檢測中，瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)操作簡便，但其敏感性不高。ELISA方法具有較高的靈敏性和特異性，是世界衛(wèi)生組織推薦的診斷方法之一。近年來我國學(xué)者研究的側(cè)重點(diǎn)主要是PCR方法，此方法多基于P32基因、ITR基因、A29L基因、末端反向重復(fù)序列等設(shè)計(jì)引物，具有靈敏度高、特異性好、快速等優(yōu)點(diǎn)，其中以熒光定量PCR方法最好，可作為實(shí)驗(yàn)室診斷的有效方法。但是鑒于此方法對(duì)儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)操作人員以及實(shí)驗(yàn)的條件等均由有較高的要求，在檢測成本有限的情況下推廣此方法有較高的難度。

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