魏 超,代曉航，郭靈安，劉 煒

(四川省農(nóng)科院分析測(cè)試中心，四川 成都 610066)

基質(zhì)解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS )是一種軟電離有機(jī)質(zhì)譜，通過(guò)基質(zhì)吸收激光的能量，并將部分能量傳遞給樣品，幫助樣品離子化，根據(jù)其質(zhì)量與電荷的比(質(zhì)核比m/z)進(jìn)行檢測(cè)[1]。MALDI-TOF MS通過(guò)基質(zhì)輔助電離微生物蛋白質(zhì)，使其片段化成大分子多肽，而獲得肽指紋圖譜進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)槲⑸锏鞍踪|(zhì)具有特異性和保守性，不受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件影響，所以其多肽指紋圖譜也具有特異性和保守性。根據(jù)得到的不同微生物的特征性譜峰，通過(guò)檢索特征性質(zhì)譜峰數(shù)據(jù)庫(kù)或與已知微生物的質(zhì)譜峰比較，達(dá)到對(duì)微生物進(jìn)行快速檢測(cè)、鑒定和分型的目的[2]。從分子生物學(xué)的角度看,核酸決定蛋白的表達(dá)，但蛋白質(zhì)的豐度受其穩(wěn)定性、翻譯效率和其他蛋白質(zhì)的豐度調(diào)控以及后修飾等影響，因此，基于蛋白質(zhì)水平的微生物分析相比核酸水平進(jìn)行的分析可獲得更多的微生物信息[1,3-4]。解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)因與克雷伯菌屬在基因水平的差異被從克雷伯菌屬中的解鳥氨酸克雷伯菌分離出來(lái)[5-6]，此菌可引起溶血癥，在患者的痰液、尿液、膽汁中均有檢出[7-9]，其毒力基因blaKPC-2與肺炎克雷伯菌相同[10]，此外解鳥氨酸拉烏爾菌的一些分離菌次生代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性，常被用作工程菌株[11]。肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)在自然界中廣泛分布于土壤、水、果蔬，也見于人和動(dòng)物的腸道中，該菌常被分離于醫(yī)學(xué)臨床標(biāo)本中，在適宜或特定的條件下，能引起人感染發(fā)病，致病作用較廣泛[5]，此外由于拉烏爾菌屬與克雷伯菌屬特征生化反應(yīng)比較接近，所以在商業(yè)化鑒定系統(tǒng)中常發(fā)生誤判的情況[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)采用MALDI-TOF MS方法對(duì)芽苗菜中解鳥氨酸拉烏爾菌和肺炎克雷伯菌進(jìn)行鑒定和蛋白質(zhì)特征性分析，目的在于優(yōu)化數(shù)據(jù)庫(kù)使其更適合農(nóng)產(chǎn)品非常見微生物的檢測(cè)與危害性評(píng)估。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

MALDI-TOF-MS(島津，AXIMA Confidence)，微生物鑒定儀(生物梅里埃公司，ATB)，生化培養(yǎng)箱(寧波東南生物儀器有限公司，DHP-9082)，PCR擴(kuò)增儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，SimpliAmp)。

蛋白質(zhì)緩沖水(BPW)、麥康凱瓊脂(MAC)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；乙醇、乙腈(色譜純,Fisher Scientific)；甲酸(色譜純,Tedia公司)；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)(Sigma公司 )；微生物鑒定生化試劑條(生物梅里埃公司，ID32E)，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

芽苗菜(金絲柳苗，松柳苗)30份樣品來(lái)自成都大型超市，超市分布覆蓋大成都范圍。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1微生物的盲篩稱取25 g樣品，225 mL BPW均質(zhì)后36 ℃培養(yǎng)16 h，增菌液劃線于EMB和MAC培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)24 h，每份樣品每種培養(yǎng)條件分別挑取6個(gè)單菌落用于進(jìn)一步純化，36 ℃培養(yǎng)36 h后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.2.2分離微生物的質(zhì)譜鑒定樣品前處理：在1.0 mL乙醇水溶液(體積比70∶30)中加入10 μL接種環(huán)移取適當(dāng)菌量，振蕩30 s后離心1 min，棄溶液，加入0.75 mL乙酸-水溶液(體積比5∶25)振蕩20 s，于25 ℃、40 kHz超聲10 min，加入0.75 mL乙腈振蕩均勻,4 000 r/min離心1 min取上清液1 μL點(diǎn)至靶板，揮干加入1 μL CHCA，揮干。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI),氮?dú)饧す馄?，固定聚?37 nm，檢測(cè)器線性模式-電子倍增管(Multiple dynode)，激光束能頻75～80 Hz，收集范圍2 000～20 000(m/z)，每個(gè)樣品200次收集峰疊加，校準(zhǔn)品ATCC 8739大腸桿菌，每16個(gè)樣品校正2次，分離微生物獲得的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入MALDI-TOF/SARAMIS微生物鑒定系統(tǒng)與其中的超級(jí)譜圖進(jìn)行多重比較分析，獲得微生物的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

1.2.3微生物標(biāo)識(shí)峰優(yōu)化及相關(guān)性分析收集質(zhì)譜圖譜導(dǎo)入MALDI-TOF/SARAMIS微生物鑒定系統(tǒng)，采用SARAMIS Premium軟件中的Superpectrum和Taxonomy進(jìn)行標(biāo)記峰足跡圖繪制、標(biāo)識(shí)峰整理與微生物同源性分析。

1.2.4微生物的生化鑒定“1.2.1”中EMB和MAC純化單菌落劃線到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h，挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)菌落至0.85%生理鹽水比濁管，振蕩分散，將菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，每?5 μL分裝于ID32E 試劑條試劑杯中,36 ℃培養(yǎng)24 h，ATB系統(tǒng)自動(dòng)讀取試劑條信息并給出最終結(jié)果。

1.2.5微生物16srDNA的相關(guān)分析25 μL PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接，獲得序列結(jié)果并提交NCBI比對(duì)，采用MAGA7.0軟件最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony)進(jìn)行序列分析構(gòu)建發(fā)育樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 解鳥氨酸拉烏爾菌及肺炎克雷伯菌的分離與鑒定

采用兩種分離培養(yǎng)基在30份樣品中分離得到解鳥氨酸拉烏爾菌12株(其中EMB培養(yǎng)基2株，MAC培養(yǎng)基10株，來(lái)自10份樣品)，解鳥氨酸拉烏爾菌的檢出率為33.3%。肺炎克雷伯菌分離得到15株(其中MAC分離得到10株，EMB分離5株，來(lái)自13份樣品)，分離率43.3%，兩種微生物的質(zhì)譜圖見圖1，質(zhì)譜對(duì)兩種微生物獲得很好的鑒定結(jié)果。取得有效結(jié)果的兩種微生物的生化圖譜見表1，部分質(zhì)譜鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌的微生物生化結(jié)果為克雷伯菌(Klebsiellaspp)。

因生化反應(yīng)的相似拉烏爾菌屬經(jīng)常被誤認(rèn)為克雷伯菌屬細(xì)菌[5,13]。已有研究中芽苗菜中解鳥氨酸拉烏爾菌和肺炎克雷伯菌檢出率較高，由生化圖譜可以看出兩種微生物在32個(gè)生化反應(yīng)中大部分表現(xiàn)一致(表1)，僅鳥氨酸脫羧酶和天門冬素芳胺酶生化反應(yīng)不一致，其中鳥氨酸脫羧酶陽(yáng)性為鑒定拉烏爾菌屬內(nèi)解鳥氨酸種的特征性反應(yīng)，天門冬素芳胺酶實(shí)驗(yàn)在拉烏爾菌屬其余種中也可能表現(xiàn)為陰性。雖然本實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種微生物的生化鑒定取得了有效的結(jié)果，但部分質(zhì)譜鑒定解鳥氨酸拉烏爾菌的微生物生化鑒定結(jié)果有一定的差異，獲得結(jié)果為克雷伯菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種微生物較難區(qū)分，與已有文獻(xiàn)一致。

表1 解鳥氨酸拉烏爾菌和肺炎克雷伯菌的生化圖譜Table 1 Biochemistry map of K.pneumoniae and R.ornithinolytica

ODC(鳥氨酸脫羧酶),AHD( 精氨酸雙水解酶)，LDC(賴氨酸脫羧酶)，URE(尿素酶)，LARL(L-阿拉伯醇)，GAT(d-半乳糖酸鹽同化)，5KG(5酮基·葡萄糖酸鈉)，LIP(酯酶)，RP(酚紅)，βGLU(β-葡萄糖苷酶)，MAL(d-麥芽糖)，IND(吲哚)，βNAG(β-氮乙酰葡萄糖胺)，βGAL(半乳糖苷酶)，GLU(d-葡萄糖)，SAC(蔗糖)，LARA(L-阿拉伯糖)，DARL(D-阿拉伯醇)，αGLU(α-葡萄糖苷酶)，αGAL(α-半乳糖苷酶)，TRE(d-海藻糖)，RHA(L-鼠李糖)，INO(肌醇)，ADO(側(cè)金盞花醇)，PLE(古老糖)，βGUR(β-葡萄糖醛縮酶)，CEL(d-纖維二糖)，SOR(d-山梨醇)，αMAL(α-麥芽糖苷酶)，MAN(d-甘露醇)，MNT(丙二酸鹽),AspA(L-天門冬素芳胺酶)

2.2 解鳥氨酸拉烏爾菌和肺炎克雷伯菌質(zhì)譜特征峰的研究

足跡圖可直觀表現(xiàn)微生物質(zhì)譜標(biāo)識(shí)峰的位置(包括<0.08的相對(duì)偏差)，芽苗菜中分離的12株解鳥氨酸拉烏爾菌以及肺炎克雷伯菌的標(biāo)識(shí)峰足跡圖顯示，在小質(zhì)核比(m/z<5 000)區(qū)域內(nèi)標(biāo)識(shí)峰比較密集，隨著質(zhì)核比增大，標(biāo)識(shí)峰逐漸減少，但盡管鑒定為同種微生物，其標(biāo)識(shí)峰的數(shù)目、質(zhì)核比軌跡仍相差較多，即便數(shù)據(jù)庫(kù)中的超級(jí)譜圖間差距也比較大。

圖1 微生物鑒定質(zhì)譜圖譜Fig 1 Microorganism mass spectra of MALDI-TOF MS A:R.ornithinolytica(解鳥氨酸拉烏爾菌),B:K.pneumoniae(肺炎克雷伯菌)，C:Calibration E.coli ATCC 8739(標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌 ATCC8739)

對(duì)芽苗菜中分離的解鳥氨酸拉烏爾菌的全部標(biāo)識(shí)峰進(jìn)行擬合(包含<0.08的相對(duì)偏差)，12株微生物共有18組質(zhì)核比標(biāo)識(shí)峰完全擬合(圖2A)，再添加4組超級(jí)譜圖數(shù)據(jù)后，16組解鳥氨酸拉烏爾菌完全擬合的標(biāo)識(shí)峰為16組(圖2B)，減少為質(zhì)核比(m/z)5 599.6和5 618.3(包含<0.08的絕對(duì)偏差)的兩組標(biāo)識(shí)峰，這兩組峰響應(yīng)值較高可認(rèn)為是芽苗菜分離菌種的特有譜峰，完全擬合的16組標(biāo)識(shí)峰可認(rèn)定為解鳥氨酸拉烏爾菌的特征峰，將16組峰上傳至SARAMIS Premium數(shù)據(jù)系統(tǒng)，對(duì)其加權(quán)以提高系統(tǒng)對(duì)解鳥氨酸拉烏爾菌的分辨能力。

對(duì)分離的肺炎克雷伯菌的全部標(biāo)識(shí)峰進(jìn)行擬合(包含<0.08的相對(duì)偏差)，15株微生物共有16組標(biāo)識(shí)峰完全擬合(圖3A)，再添加4組超級(jí)譜圖數(shù)據(jù)后，19組肺炎克雷伯菌完全擬合的標(biāo)識(shí)峰有10組(圖3B)，減少的5組標(biāo)識(shí)峰中有3組峰的響應(yīng)值較低，剩余2組峰的響應(yīng)值較高可認(rèn)為是芽苗菜分離菌種特有譜峰，完全擬合的10組標(biāo)識(shí)峰可認(rèn)定為解鳥氨酸拉烏爾菌的特征峰，將其上傳至SARAMIS Premium數(shù)據(jù)系統(tǒng)，對(duì)其加權(quán)以提高系統(tǒng)對(duì)解鳥氨酸拉烏爾菌的分辨能力。

質(zhì)譜鑒定微生物是根據(jù)其特征峰擬合進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算獲得鑒定結(jié)果，數(shù)據(jù)庫(kù)的容量和特征峰的權(quán)重決定鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，SARAMIS Premium是一個(gè)開放平臺(tái)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)生化相似的兩種微生物進(jìn)行特征峰整理和加權(quán)，還可針對(duì)更多樣的農(nóng)產(chǎn)品特征微生物進(jìn)行研究。

圖4 解鳥氨酸拉烏爾菌聚類分析樹Fig.4 R.ornithinolytica cluster dendrogram by MALDI-TOF MSA:cluster dendrogram of 12 strains of R.ornithinolytica;B:cluster dendrogram of R.ornithinolytica with weighted feature peak(A：12株解鳥氨酸拉烏爾菌進(jìn)行聚類分析；B：解鳥氨酸拉烏爾菌征峰加權(quán)后聚類分析圖)

2.3 解鳥氨酸拉烏爾菌及肺炎克雷伯菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的研究

對(duì)芽苗菜中分離的12株解鳥氨酸拉烏爾菌進(jìn)行聚類分析(圖4A)，對(duì)其特征峰加權(quán)后的聚類分析結(jié)果見圖4B，對(duì)比兩張分析圖，在特征峰加權(quán)后微生物的相關(guān)系數(shù)有所提高，兩張圖中一級(jí)分支基本一致，但更高級(jí)的分支和相對(duì)距離發(fā)生了變化。在圖4B中，13和14號(hào)圖譜為超級(jí)譜圖庫(kù)中同源樣品，聚類分析結(jié)果也顯示其相關(guān)系數(shù)>100%；1和6號(hào)為芽苗菜分離解鳥氨酸拉烏爾菌，聚類分析結(jié)果顯示其相關(guān)系數(shù)>100%，經(jīng)溯源來(lái)源于同份芽苗菜樣品的不同培養(yǎng)基的分離。肺炎克雷伯菌的聚類分析樹與特征峰加權(quán)后分析樹與圖4的分析結(jié)果相近，加權(quán)特征峰后相關(guān)系數(shù)也有所提高，一級(jí)分支基本不變，但高級(jí)分支和相關(guān)位置發(fā)生了一定變化，聚類結(jié)果顯示一級(jí)分支的5組微生物，除2組數(shù)據(jù)庫(kù)中同源微生物，另外3組6株肺炎克雷伯菌為芽苗菜中分離，經(jīng)溯源來(lái)自于3份芽苗菜樣品的不同培養(yǎng)基?？梢奙ALDI-TOF MS方法可以用于微生物的溯源，但其溯源的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步優(yōu)化SARAMIS Premium系統(tǒng)。

2.4 解鳥氨酸拉烏爾菌與肺炎克雷伯菌相似性的研究

由生化鑒定結(jié)果可以看出，兩種微生物的生化反應(yīng)非常接近，容易誤判，利用SARAMIS Premium將兩種微生物的質(zhì)譜圖譜進(jìn)行相關(guān)分析(圖5)，兩種微生物雖有部分相交但在三四級(jí)分支中仍可分辨。圖5顯示兩種微生物的相關(guān)性仍較高，最后一級(jí)分支系數(shù)仍大于50%，與“2.3”聚類分析樹中種內(nèi)最后一級(jí)分支相關(guān)系數(shù)接近，可見兩種微生物在質(zhì)譜圖中較接近但可分辨。

對(duì)兩種微生物進(jìn)行16SrDNA測(cè)序并建立相關(guān)分析系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，系統(tǒng)發(fā)育樹可將兩種微生物分于兩個(gè)分支，雖然遺傳距離很接近但仍有一定差異，兩種微生物在基因水平上區(qū)分明顯。

圖6 解鳥氨酸拉烏爾菌和肺炎克雷伯菌的16srDNA相關(guān)分析樹Fig.6 K.pneumoniae and R.ornithinolytica related analysis tree by 16srDNA1-10:R.ornithinolytica；11-23:K.pneumoniae

3 結(jié) 論

本文針對(duì)芽苗菜中分離率最高且相似程度較高的兩種微生物解鳥氨酸拉烏爾菌和肺炎克雷伯菌進(jìn)行了MALDI-TOF MS鑒定相關(guān)分析并優(yōu)化了標(biāo)識(shí)峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MALDI-TOF MS在農(nóng)產(chǎn)品相似微生物鑒定上準(zhǔn)確度較高，但其溯源和相關(guān)分析能力比傳統(tǒng)16SrDNA 方法還有一定差距，對(duì)開放數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)ARAMIS Premium進(jìn)行添加和優(yōu)化是提高M(jìn)ALDI-TOF MS對(duì)農(nóng)產(chǎn)品微生物檢測(cè)和溯源準(zhǔn)確性的主要方法。

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