★ 林雨芹季巧遇邵堅(jiān) 吳樣明 周海萍 黃茜

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司 南昌330096)

六味地黃膏由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等六味藥材組成，具有滋陰補(bǔ)腎之功效。膏滋藥歷史悠久，其效以滋補(bǔ)為主，兼有緩和的治療作用，尤其適合慢性病患者及年老體弱者調(diào)養(yǎng)之用。六味地黃膏現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》[1]WS3-B-2489-97，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已嚴(yán)重落后于現(xiàn)有六味地黃其他制劑。本文參照《中國(guó)藥典》[2]2015版一部中六味地黃制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]，采用高效液相色譜法測(cè)定六味地黃膏中莫諾苷和馬錢苷的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，表明該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于六味地黃膏的質(zhì)量控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；科昌達(dá)超聲波清洗器(南昌科昌達(dá)超聲波儀器廠)；CPA 225型電子天平(賽多利斯)；AB204-N 型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)。

1.2 材料 六味地黃膏3批(江中藥業(yè)，批號(hào)2015080001、2015080002、2015080003)；莫諾苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院111998-201501)；馬錢苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111640-201606)；乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取莫諾苷、馬錢苷適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含20μg的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取六味地黃膏1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

缺酒萸肉陰性對(duì)照溶液的制備：取缺酒萸肉陰性對(duì)照樣品1g，按供試品溶液制備方法同法制備缺酒萸肉陰性對(duì)照溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)；梯度洗脫(0～7min，5%～8% A；7～20min，8% A；20～35min，8%～20% A；35～45min，20%～80% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；柱溫為40 ℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)不低于4000，在該色譜條件下莫諾苷和馬錢苷與其他組分之間分離度良好(R>1.5)。

陰性干擾試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺酒萸肉陰性對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣10 μL，結(jié)果表明陰性無干擾，該法專屬性較強(qiáng)，見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取莫諾苷對(duì)照品10.95 mg及馬錢苷對(duì)照品10.70 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解稀釋至刻度，制成每1 mL含0.438 mg莫諾苷及0.428 mg馬錢苷的混合對(duì)照品母液。等梯度稀釋混合對(duì)照品母液，即得混合對(duì)照品溶液(莫諾苷依次為濃度5.5，11.0，21.9，43.8，87.6μg/mL，馬錢苷濃度依次為5.4，10.7，21.4，42.8，85.6μg/mL)。

精密吸取各濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按2.3項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得莫諾苷及馬錢苷的回歸方程分別為Y=16.5025X-7.1242(r=0.9999)，Y=15.7320X-1.9777(r=0.9999)。結(jié)果表明莫諾苷及馬錢苷分別在5.5～87.6μg/mL、5.4～85.6μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取莫諾苷濃度為21.9μg/mL，馬錢苷濃度為21.4μg/mL的混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，依法測(cè)定，記錄莫諾苷及馬錢苷的峰面積，RSD值分別為0.77%，0.73%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；

C.陰性對(duì)照溶液；1.莫諾苷；2.馬錢苷

圖1 莫諾苷、馬錢苷HPLC圖譜

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取六味地黃膏約1 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄莫諾苷及馬錢苷的峰面積，其RSD值分別為2.49%，1.09%，表明供試品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的六味地黃膏樣品6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定莫諾苷及馬錢苷含量，莫諾苷及馬錢苷的平均含量分別為0.6448mg/g、0.4691mg/g，RSD值分別為0.98%、1.94%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的六味地黃膏(莫諾苷含量為0.6448 mg/g，馬錢苷含量為0.4691 mg/g)0.5g(6份)，精密稱定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(莫諾苷濃度為0.3066 mg/mL，馬錢苷濃度為0.2996 mg/mL)1.0 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定莫諾苷及馬錢苷的含量，計(jì)算該方法的回收率。結(jié)果六味地黃膏中莫諾苷及馬錢苷的平均回收率分別為96.7%，91.02%，RSD值分別為1.67%，1.81%，結(jié)果表明該方法加樣回收率較好。結(jié)果見表1-2。

表1 莫諾苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 馬錢苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取三批六味地黃膏樣品，依法制備并測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 mg/g

根據(jù)藥材含量和三批樣品含測(cè)數(shù)據(jù)，初步暫定產(chǎn)品的含測(cè)限度為本品每克含莫諾苷和馬錢苷含量總和應(yīng)不低于0.30 mg。

3 討論

(1)本文建立的含測(cè)方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，表明方法方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為六味地黃膏的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

(2)本試驗(yàn)還優(yōu)化了流動(dòng)相梯度洗脫條件，使各峰得到較好的分離。

(3)本試驗(yàn)考察了超聲提取及回流提取兩種方法制備供試品，結(jié)果表明回流提取提取率優(yōu)于超聲提取，故選擇回流提取制備供試品溶液。

(4)本文根據(jù)藥材含量和三批樣品含測(cè)數(shù)據(jù)，初步暫定產(chǎn)品的含測(cè)限度為本品每克含莫諾苷和馬錢苷含量總和應(yīng)不低于0.30mg。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑第十三冊(cè)[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,1997:44.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:705-706.

[3]楊明明,袁曉旭,趙桂琴,等.山茱萸化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,33(5):398-400.

[4]李觀林.山茱萸中環(huán)烯醚萜苷類的研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2014,10(18):48-49.

[5]吳紅,梁恒,劉永紅,等. 山茱萸總皂苷的提取分離與含量測(cè)定[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24(5):430-432.