方春雪 孫和平

1 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中醫(yī)藥研究中心 （吉林 長春 130021）

2 吉林省腫瘤醫(yī)院藥物臨床試驗機構 （吉林 長春 130021）

內容提要： 近年來，高效液相色譜串聯(lián)質譜技術成為一種發(fā)展極為迅速的新興技術，在醫(yī)藥、化工、食品、農業(yè)等領域被廣泛應用。因其具有靈敏度高、專屬性強、分析時間短及重現(xiàn)性好等特點，也逐漸應用于臨床檢測和輔助診斷，為精準醫(yī)療提供技術支持。

1.總述

隨著科學技術的不斷發(fā)展，質譜檢測技術得到飛速的發(fā)展。回顧質譜儀的發(fā)展史，有幾個重要時間節(jié)點：①1912年，英國物理學家Thomson研制出了一臺簡易的質譜儀；②1942年，第一臺商用質譜儀產生；③十九世紀八九十年代，科學家相繼研發(fā)出電噴霧質譜儀及高分辨飛行時間質譜[1,2]。一百多年的質譜發(fā)展史，已經有十余個諾貝爾獎授予了與質譜相關研究及應用，足以見其技術的先進性。

液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）的應用涉及了醫(yī)藥、環(huán)境、食品、化工等各個行業(yè)。該技術結合了液相色譜的良好分離能力和串聯(lián)質譜的高特異性檢測的特點[3]，適于復雜生物樣本的分析檢測，LC-MS/MS技術在臨床診斷方面的發(fā)展勢頭尤為迅猛[4]。

2.LC-MS/MS的工作原理及特點

質譜儀是檢測帶電物質的質量差異的一類儀器。質譜的檢測原理最早由英國物理學家Thomson提出，但是由于受離子化技術的限制，最初的質譜儀僅應用于一些分子量小且熱穩(wěn)定化合物的檢測。直到20世紀90年代，電噴霧離子化技術（ESI）及基質輔助激光解析離子化技術（MALDI）的相繼開發(fā)，才使得生物質譜的研究取得跨越式發(fā)展。

2.1 質譜離子源

離子化過程對質譜檢測十分關鍵，只有將分析物變成帶電粒子并轉移到氣相中，才能被質譜儀檢測到。目前應用的離子化方法，除了上述提到的ESI及MALDI，還有大氣壓化學離子化（APCI）和大氣壓光離子化（APPI）。其中最常用的離子化方法是ESI[5]。

2.2 質量分析器

質量分析器是質譜儀的重要組成部分，其作用是將生成的離子按照質核比（m/z）將不同的待測成分分開。質量分析器主要有以下幾種：四級桿質量分析器、離子阱質量分析器及飛行時間質量分析器等。不同類型的質量分析器可以互相組合串聯(lián)，如四級桿-離子阱串聯(lián)質譜、四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜等。

2.3 生物樣本的LC-MS/MS分析

生物樣本的組分比較復雜，因此需要在進行LC-MS/MS分析前對待測樣本進行提純。常用的前處理方法主要有蛋白質沉淀法（PPT）、液液萃取法（LLE）和固相萃取法（SPE）等。

樣品經過前處理后，還需要進行適當?shù)姆蛛x。目前常用的分離技術有毛細管電泳（CE）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等。生物樣本經過前處理，再由HPLC進行色譜分離，在離子源處離子化形成帶電離子，然后進入質譜系統(tǒng)。LC-MS/MS分析方法既包含了液相色譜高效的分離速度和更好的分離度，同時也具備了質譜分析的超強的專屬性和超高的靈敏度，成為臨床檢測領域最富有活力的新技術之一。

3.LC-MS/MS技術在臨床上的應用

3.1 全譜氨基酸檢測

全譜氨基酸在體內處于一個動態(tài)平衡，一旦這種平衡被破壞，便會引發(fā)人體的眾多疾病。全譜氨基酸在體內涉及到免疫、神經系統(tǒng)、激素分泌、物質代謝及能量代謝等諸多環(huán)節(jié)[6]。因此，其檢測對健康評估和疾病診斷具有重要意義[7]。

時正媛等[8]使用UPLC-MS/MS方法建立了人體血清中包括丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸等在內的13種氨基酸含量測定的方法。以13種同位素標記的氨基酸混合物為內標物質，血清樣本用蛋白質沉淀法進行前處理，取上清液進行UPLC-MS/MS分析。分析時間短、特異性強、靈敏度高。為全譜氨基酸檢測提供實驗依據(jù)。

3.2 同型半胱氨酸檢測

同型半胱氨酸（HCY）是引起心腦血管疾病的獨立危險因素。1969年Mccully提出了高同型半胱氨酸血癥能夠導致動脈粥樣硬化疾病的假說。該假說認為HCY能引起血管內皮系統(tǒng)的損傷，加快血管平滑肌細胞的增殖，對低密度脂蛋白的氧化產生影響，同時增強血小板功能，促進血栓形成。因此，測定HCY對于心腦血管疾病的預防和早期診斷具有重要意義[9]。

趙瑞等[10]收集63例進行HCY檢測的血清樣本，用LCMS/MS法和循環(huán)酶法分別測定了63例血清樣本中的HCY濃度。樣本前處理中使用三氯醋酸銨作為沉淀劑，線性關系良好，用Spearman法對2種方法進行相關性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.3 類固醇激素檢測

類固醇激素是一種弱極性的小分子激素，主要由腎上腺、胎盤和生殖腺產生。類固醇激素主要包括雄激素、雌激素、孕激素、糖皮質激素和鹽皮質激素等，體內激素水平的變化，可以作為疾病診斷的依據(jù)之一。如醛固酮增生癥、先天性腎上腺皮質增生、庫欣綜合征及先天代謝缺陷等，都會導致體內相應激素水平的變化。因此，機體類固醇激素水平的測定，可以作為疾病診斷的依據(jù)。

高潔等[11]使用固相萃取技術結合UPLC-MS/MS法建立了快速準確的52種類固醇激素的聯(lián)合測定方法。其中包括20種雄激素、8種雌激素、10種孕激素及14種糖皮質激素。樣品用β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶水解后，經乙腈超聲提取，過固相萃取柱，處理后進行UPLC-MS/MS分析。質譜采用電噴霧正/負離子多反應監(jiān)測模式（MRM）檢測，方法簡便快捷、專屬性強、靈敏度高，為質譜檢測類固醇激素提供了可靠依據(jù)。

3.4 T3/T4分析

三碘甲狀腺原氨酸（T3）/甲狀腺素（T4）與甲狀腺功能紊亂及甲狀腺癌密切相關。人群中大約有4～10%的成人有甲狀腺功能紊亂的癥狀。其中女性甲狀腺癌發(fā)病率為3～16人/萬人，與男性發(fā)病率相比，高出約3～4倍。甲狀腺癌是一種常見癌癥，易于診斷且死亡率低，因此T3/T4的檢測對預防甲狀腺癌具有重要意義。

人體血液中的T3和T4大部分以結合態(tài)存在（約99%），如甲狀腺素結合球蛋白（TBG）游離態(tài)才有生物活性。臨床上通常采用放射性免疫分析法檢測T3/T4，但該方法可能會導致假陽性。國際臨床化學協(xié)會（IFCC）提出要對血清游離甲狀腺素的標準化檢測方法進行規(guī)范，該檢測主要基于平衡透析法結合LC-MS/MS進行。足以見得LC-MS/MS分析方法在該檢測項目上的必要性。

4.結語

高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術代表當今精準醫(yī)療發(fā)展方向之一，可實現(xiàn)多種分析物的同時測定，對健康評估和疾病診斷均具有重要意義。