汪華新，肖業(yè)達，趙博，唐朝亮，黃亞醫(yī)，詹麗英，高文蔚

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 1.麻醉科，2.重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430060）

腎缺血再灌注損傷是導(dǎo)致急性腎損傷的主要原因，也是臨床上常見的病理生理過程，可發(fā)生休克、腎移植術(shù)及心臟大血管手術(shù)等情況。氧化應(yīng)激和強炎癥反應(yīng)則是腎缺血再灌注損傷最為重要的原因之一[1-2]。炎性體3蛋白（nod-like receptor protein 3，NLRP3）/白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）炎癥通路在腎缺血再灌注損傷中起到重要作用，而硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）可以激活NLRP3/IL-1β炎癥通路[3-4]。本研究擬評價TXNIP激活NLRP3/IL-1β炎癥通路在大鼠急性腎損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及分組

清潔級健康成年雄性Sprague Dawley大鼠16只，體重200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。采用隨機數(shù)字表法分為2組（n=8）：假手術(shù)組（S），缺血再灌注組（IR）。

1.2 大鼠腎缺血再灌注損傷模型的復(fù)制

大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉60 mg/kg后，腹腔注射500 u普通肝素鈉抗凝，取腹部正中切開顯露腎臟，在雙側(cè)腎蒂處進行鈍性分離，無創(chuàng)血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂25 min后開放，腎臟由鮮紅轉(zhuǎn)為暗紅偏黑表明阻斷成功，腎臟由暗紅偏黑恢復(fù)到鮮紅提示再灌注成功。

1.3 指標(biāo)測定

再灌注48 h后處死大鼠，取腎組織和血標(biāo)本，①HE染色觀察大鼠病理學(xué)結(jié)果，腎臟標(biāo)本浸泡于10%中性甲醛固定液固定24 h，石蠟包埋，用切片機將其切成4 μm石蠟薄片，切片常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇后水洗，常規(guī)脫水，封片后光鏡下觀察病理學(xué)結(jié)果；②左心室取血標(biāo)本檢測血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，Scr）水平，血標(biāo)本1 ml，3 000 r/min離心5 min，取血清，采用全自動生化分析儀測定BUN和Scr；③取新鮮腎組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，設(shè)為對照組和空白對照組，按試劑盒實驗步驟采用比色法檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量（南京建成生物工程研究所）；④應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）進行腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒（美國Roche公司）說明書進行操作；⑤采用Western blot測定TXNIP，NLRP3：用BCA試劑測定蛋白濃度，配制12%的SDS-PAGE膠電泳，取50 μg總蛋白上樣行電泳檢測，依據(jù)預(yù)染Marker顯示，判斷目的蛋白分離后停止電泳，按黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-纖維墊-白色板的順序依次放好，夾緊板后放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)進行冰浴轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件：TXNIP：-200 mA，90 min；NLRP：3 0～200 mA，100 min后300 mA，25 min；脫脂奶粉室溫封閉1～2 h。加入單克隆抗體TXNIP（1∶500，英國Abcam公司）、NLRP3（1∶200，美國Nous Biologicals美國）4℃孵育過夜。次日二抗（抗兔，1∶5 000，美國Invitrogen公司）孵育1 h后，用TBST充分洗滌6次，每次5 min。顯色曝光，圖像分析系統(tǒng)掃描并對膠片條帶的光密度值定量；⑥采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測IL-1β（伊萊瑞特生物科技有限公司），嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 6.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理損傷

HE染色光鏡下觀察，IR組腎小管腫脹明顯，間質(zhì)水腫，刷狀緣丟失，空泡變性壞死，表現(xiàn)出明顯的腎組織病理損傷。見圖1。

2.2 血BUN、Scr、腎組織SOD、MDA及凋亡指數(shù)的比較

與S組比較，IR組BUN、Scr及MDA表達增高（P＜0.05），而SOD活性降低（P＜0.05）。與 S組比較，IR組凋亡指數(shù)增高（P＜0.05）。見附表和圖2。

2.3 腎組織TXNIP、NLRP3及IL-1β的含量

與S組比較，IR組TXNIP表達升高（t=11.290，P=0.000），IR組NLRP3蛋白表達也升高（t=13.220，P=0.000），同時伴隨炎癥因子IL-1β表達增高（t=24.130，P=0.000）。見圖 3。

圖1 腎小管染色結(jié)果 （HE×200）

圖2 細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×400）

附表 兩組血BUN、Scr、腎組織SOD、MDA及凋亡指數(shù)的比較 （n =8，±s）

附表 兩組血BUN、Scr、腎組織SOD、MDA及凋亡指數(shù)的比較 （n =8，±s）

注：?與S組比較，P ＜0.05

?

圖3 兩組腎組織TXNIP、NLRP3及IL-1β的含量

3 討論

急性腎損傷可以導(dǎo)致腎功能急劇喪失，其發(fā)病率和致死率較高，而腎缺血再灌注損傷是其主要病因[5-6]。腎臟作為圍術(shù)期最早和最易受損的器官之一，亦是繼發(fā)心、腦及肺等重要臟器損傷進而導(dǎo)致多器官功能衰竭的始動器官。因此，深入闡明腎缺血再灌注后的變化及主要調(diào)控機制成為亟待解決的臨床熱點問題。

研究表明，氧化應(yīng)激反應(yīng)是加重腎缺血再灌注損傷的重要因素，更為重要的是慢性氧化應(yīng)激可以消除預(yù)處理對缺血再灌注損傷的保護作用[7-8]。故氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞信號通路的激活對缺血性急性腎損傷的作用機制是研究的重點和熱點。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注期間，大鼠血清BUN和Scr急劇升高，腎功能受損嚴(yán)重，進而發(fā)現(xiàn)腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)：MDA增高，SOD下降，證實大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增高，清除氧自由基能力降低。

TXNIP作為1種新的信號分子參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，是硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）的內(nèi)源性抑制劑，具有抑制TRX清除活性氧自由基的能力[9-10]。最近研究指出TXNIP通過與NLRP3直接相互作用從而激活NLRP3通路，而NLRP3作為重要的炎癥識別受體在機體抵御病原體入侵中發(fā)揮重要作用[11]。本研究結(jié)果表明，缺血再灌注期間，TXNIP表達增加，進而激活NLRP3，導(dǎo)致IL-1β表達增多，引起機體炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的爆發(fā)。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后凋亡指數(shù)明顯增高，作為檢測細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)，從另一角度證實，由于炎性介質(zhì)的爆發(fā)性產(chǎn)生導(dǎo)致機體失衡，從而增強氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡數(shù)目增多，引起腎功能的嚴(yán)重受損。

綜上所述，TXNIP可能通過激活NLRP3/IL-1β炎癥通路參與腎缺血再灌注損傷的過程。

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