梅 雪，羅 雋，夏 青，馮婭茹，索亞然，李二文，王昭懿，馬志強(qiáng)，林瑞超

甘遂為大戟科植物甘遂（Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.RWang）的干燥塊根，可瀉水逐飲，消腫散結(jié)。常用于肝硬化腹水、胸腔積液、水腫等病癥[1]，現(xiàn)代臨床也用于治療晚期食道癌、乳腺癌等腫瘤及慢性支氣管炎等疾病[2]。藥理研究表明，甘遂具有抗腫瘤、抗病毒、治療胰腺炎、免疫抑制等多種藥理活性[3-4]，但其毒性作用卻嚴(yán)重制約著它的臨床應(yīng)用。

斑馬魚(yú)具有繁殖速度快、子代數(shù)量多、胚胎透明等生物學(xué)特性，目前已在藥理和毒理研究方面得到了廣泛的應(yīng)用[5]。利用斑馬魚(yú)模型可以高效、直觀地評(píng)價(jià)藥物的心血管、肝臟、腎臟和神經(jīng)等靶器官毒性[6]，研究數(shù)據(jù)表明該模型對(duì)藥物的心血管、肝臟、胃腸道和神經(jīng)毒性的評(píng)價(jià)結(jié)果與人體試驗(yàn)結(jié)果的一致性平均達(dá)到了80%以上[7-9]。斑馬魚(yú)模型系統(tǒng)既具有細(xì)胞等體外實(shí)驗(yàn)用藥量少、費(fèi)用低、周期短、高通量等特點(diǎn)，又具備整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可觀察多個(gè)器官[10]、涵蓋體內(nèi)代謝與內(nèi)環(huán)境變化對(duì)藥物的毒性影響等優(yōu)勢(shì)。斑馬魚(yú)幼魚(yú)模型克服了細(xì)胞和化學(xué)篩選模型的局限性，從整體水平直觀地評(píng)估藥物的毒性作用，很好填補(bǔ)了細(xì)胞模型和嚙齒動(dòng)物模型過(guò)渡的空白[11]。

目前關(guān)于甘遂的毒性評(píng)價(jià)比較混亂，有關(guān)實(shí)驗(yàn)證明其確實(shí)存在較強(qiáng)的毒性作用，但均存在對(duì)其毒性特征描述不確切，靶器官研究不充分，毒性可逆性研究缺失等問(wèn)題[12-15]。故本實(shí)驗(yàn)擬用斑馬魚(yú)幼魚(yú)為模型，評(píng)價(jià)甘遂不同極性溶劑提取物毒性差異，完善對(duì)甘遂的毒性評(píng)價(jià)，同時(shí)為該模型在中藥毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和試劑 去離子水、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉等為分析純，購(gòu)自北京化工廠。氯化鈣、三卡因、甲基纖維素等購(gòu)自Sigma公司。干酵母片購(gòu)自北京同仁堂。

1.2 動(dòng)植物 甘遂購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定為大戟科植物甘遂的干燥塊莖。

野生型AB系斑馬魚(yú)，購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心。豐年蝦，購(gòu)于天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。草履蟲(chóng)，實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖。

1.3 儀器 斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生科技公司），恒溫培養(yǎng)箱LRH-250Z（廣州瑞明儀器有限公司），蔡司體式熒光顯微鏡（Zeiss,Axio Zoom V16），數(shù)顯恒溫水浴鍋（天津泰斯特有限公司），ZDHW電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司），真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 甘遂提取物及幼魚(yú)暴露液的制備 稱取甘遂生品50 g，粉碎，過(guò)40目篩，置于索氏提取器中，依次按順序以10倍質(zhì)量的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、95%乙醇為溶劑，進(jìn)行連續(xù)提取。每個(gè)溶劑提取6 h，更換提取溶劑時(shí)，揮干藥材粉末中所含上一溶劑。所得提取液經(jīng)濃縮干燥后，存于干燥器中備用。

以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，制備500 mg/mL的提取物母液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用幼魚(yú)養(yǎng)殖水將母液稀釋至所需濃度。

2.2 斑馬魚(yú)幼魚(yú)的繁育 斑馬魚(yú)成魚(yú)養(yǎng)殖于斑馬魚(yú)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，控制水溫（28.0±0.5）℃，光照周期為明暗14∶10 h交替，系統(tǒng)水pH為6.8～7.2，電導(dǎo)率為400～500μs，每日喂食新孵化的豐年蝦3次。產(chǎn)卵前1 d晚上按雌雄1∶2比例配魚(yú)，第2天待產(chǎn)卵完成后，收集受精卵，挑除死卵及雜質(zhì)，用幼魚(yú)養(yǎng)殖水清洗3次，置于28.5℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照周期為明暗 14∶10 h。

2.3 甘遂不同提取物毒性比較 顯微鏡下挑選發(fā)育正常的受精后3 d（dpf）幼魚(yú)，置于12孔板中，每孔20條幼魚(yú)，給予暴露液3 mL，連續(xù)給藥72 h，每24 h 更換暴露液。預(yù)實(shí)驗(yàn)以 0.01、0.1、1、10、100、200、500μg/mL提取物為給藥濃度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整給藥濃度，確定甘遂暴露給藥72 h（hpe）的最大不致死濃度和最小全致死濃度，并在此區(qū)間選擇設(shè)定成等差數(shù)列的6～8個(gè)藥物濃度建立致死曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)以給藥后72 hpe斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡率與實(shí)驗(yàn)濃度梯度呈良好線性關(guān)系（r2≥85%），且半數(shù)致死濃度（LC50）的RSD≤0.1為有效值。

根據(jù)致死曲線計(jì)算各提取物半數(shù)致死濃度，根據(jù)LC50及所含原生藥量比較不同溶劑連續(xù)提取物的毒性差異，并根據(jù)致死曲線計(jì)算最毒提取物的最小致死濃度（LC1）、和 10%致死濃度（LC10）。

2.4 毒性指標(biāo)及可逆性觀察 以幼魚(yú)養(yǎng)殖水為空白對(duì)照組，以含助溶劑0.1%DMSO的幼魚(yú)養(yǎng)殖水為溶劑對(duì)照組，選用 1/10 LC1、1/3 LC1、LC1、LC104 個(gè)濃度作為毒性指標(biāo)及可逆性觀察的給藥濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)立6個(gè)重復(fù)組，其中3組給藥72 h后，觀察暴露液對(duì)各個(gè)臟器系統(tǒng)毒性指標(biāo)產(chǎn)生的影響，另外3組給藥72 h后，吸除暴露液并用養(yǎng)殖水清洗3次，置于12孔板中以養(yǎng)殖水培養(yǎng)恢復(fù)48 h，觀察毒性可逆性。各給藥組及恢復(fù)組于體式顯微鏡下觀察并拍照，記錄各毒性觀察指標(biāo)的變化。

2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察 給藥和恢復(fù)結(jié)束后，存活幼魚(yú)以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗3次，置于離心管中，加4%多聚甲醛于4℃固定24 h，常規(guī)切4μm切片。染色步驟如下：1）切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗：二甲苯（I）6 min→二甲苯（Ⅱ）6 min→100%乙醇6 min→95%的乙醇6 min→80%乙醇6 min→75%乙醇6 min→蒸餾水洗6 min。2）蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗。3）鹽酸乙醇分化10 s。4）自來(lái)水浸泡15 min。5）置伊紅液2 min。6）常規(guī)脫水，透明，封片：95%乙醇（I）1 min→95%乙醇（Ⅱ）1 min→100%乙醇（I）1 min→100%乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3∶1）1 min→二甲苯（I）1 min→二甲苯（Ⅱ）1 min→中性樹(shù)脂封固。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甘遂提取率 按照上述實(shí)驗(yàn)方法制備得到甘遂不同溶劑提取物，提取率依次分別為石油醚6.32%、二氯甲烷1.92%、乙酸乙酯1.85%、95%乙醇3.31%。

3.2 甘遂不同提取物毒性差異 按上述2.2及2.3方法，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了甘遂不同提取部位的實(shí)驗(yàn)濃度，重復(fù)給藥3次，統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡數(shù)，根據(jù)斑馬魚(yú)幼魚(yú)死亡率建立致死曲線，見(jiàn)圖1，并計(jì)算LC50。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘遂不同提取部位毒性依次為石油醚＞二氯甲烷＞乙酸乙酯＞乙醇提取物；LC50依次為（0.107±0.006）、（0.416±0.005）、（4.516±0.035）、（24.281±1.370）μg/mL。故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將主要以石油醚提取物為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)甘遂毒性。

3.3 甘遂毒性及可逆性觀察

3.3.1 心臟毒性 如圖2所示，給藥組和恢復(fù)組斑馬魚(yú)幼魚(yú)心臟未出現(xiàn)心包水腫、出血瘀血等異?，F(xiàn)象，顯微鏡下觀察心臟形態(tài)正常，心區(qū)血流正常、無(wú)心律不齊。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，給藥組和恢復(fù)組均與對(duì)照組心率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明甘遂無(wú)心臟毒性。見(jiàn)表1。

3.3.2 神經(jīng)毒性 如圖2所示，斑馬魚(yú)腦部未出現(xiàn)水腫、畸形等異常形態(tài)，腦區(qū)顏色正常，說(shuō)明腦部未發(fā)生變性，說(shuō)明甘遂無(wú)腦毒性。

3.3.3 胃腸道刺激性 如圖2所示，結(jié)合鏡下觀察，斑馬魚(yú)胃腸道區(qū)域顏色略有變化，變得灰暗，顯示可能出現(xiàn)輕微腸變性，鏡下腸褶皺無(wú)明顯變化。0.050 和0.070μg/mL組腸腔略有變小，可能為毒性變化所致。腸道尼羅紅排泄實(shí)驗(yàn)顯示排泄率呈劑量依賴性增高（熒光強(qiáng)度越低說(shuō)明排泄率越高），說(shuō)明甘遂具有胃腸道刺激性。見(jiàn)表2。

圖1 甘遂不同溶劑提取物致死曲線Fig.1 Lethal curve of Radix Kansuiextracted with different solvent

表1 甘遂給藥組及恢復(fù)組相對(duì)心率（x±s）Tab.1 Relative heart rate in Radix Kansuitreatment and recovery group（x±s）

3.3.4 肝臟毒性 如圖3所示，正常的斑馬魚(yú)肝臟界限清晰，紋理清晰均勻，給藥后肝臟界限變模糊且肝區(qū)顏色變?yōu)榛野瞪?，紋理混亂。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3和表4，給藥組肝臟面積在0.070μg/mL給藥組中顯著增大，停藥后恢復(fù)48 h，相對(duì)肝面積進(jìn)一步增大，說(shuō)明甘遂高濃度使幼魚(yú)肝臟腫大，且停藥后肝腫大未出現(xiàn)可逆性；給藥組肝臟面積在0.050μg/mL給藥組中未顯著增大，但停藥后恢復(fù)48 h，相對(duì)肝面積進(jìn)一步增大，說(shuō)明此濃度會(huì)造成持續(xù)性肝損傷；給藥后肝區(qū)光強(qiáng)度在 0.005、0.050、0.070 μg/mL 給藥組中顯著降低，停藥后恢復(fù)48 h光強(qiáng)度出現(xiàn)可逆性。綜上所述，說(shuō)明甘遂具有肝毒性，可使肝腫大和肝變性，肝腫大不可逆，而肝變性具有可逆性。

3.3.5 腎毒性 如圖4所示，斑馬魚(yú)軀體形態(tài)正常，未出現(xiàn)腎性水腫等異?，F(xiàn)象，說(shuō)明甘遂無(wú)腎臟毒性。3.3.6 其他毒性特征觀察結(jié)果 如圖4所示，與對(duì)照組相比，給藥后斑馬魚(yú)眼、下頜、身體著色、魚(yú)鰾、肌肉和魚(yú)鰭等均無(wú)異常，全身無(wú)出血、淤血等現(xiàn)象。

圖2 甘遂心臟區(qū)域、腦區(qū)和腸區(qū)形態(tài)變化（×80）Fig.2 Morphological changesof heart,nervoussystem and gastrointestinal tract in Radix Kansui（×80）

表2 甘遂給藥組腸染色相對(duì)熒光強(qiáng)度（x±s）Tab.2 Relative fluorescenceintensity of intestinal staining in Radix Kansuitreatment group（x±s）

圖3 甘遂肝臟形態(tài)變化（×80）Fig.3 Morphological changes of liver in Radix Kansui（×80）

表3 甘遂給藥組及恢復(fù)組肝區(qū)相對(duì)肝面積（x±s）Tab.3 Relative liver area of Radix Kansuitreatment and recovery group（x±s）

表4 甘遂給藥組及恢復(fù)組肝區(qū)相對(duì)光強(qiáng)度（x±s）Tab.4 Relative liver light intensity of Radix Kansui treatment and recovery group（x±s）

3.3.7 HE染色結(jié)果 如圖5所示，甘遂給藥后對(duì)肝臟組織損害較大?？瞻捉M和溶劑對(duì)照組中，肝臟、腸道等區(qū)域細(xì)胞完整，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞質(zhì)均勻。在甘遂LC10濃度給藥組中，肝臟細(xì)胞排列松散，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，空泡現(xiàn)象增多，細(xì)胞界限不明晰。在恢復(fù)組中，雖略有所好轉(zhuǎn)，但肝細(xì)胞毒性損害仍比較明顯。

圖4 甘遂腎性水腫觀察結(jié)果及其他毒性指標(biāo)形態(tài)變化（×30）Fig.4 Nephrogenic edema and morphological changesof other toxic index in Radix Kansui（×30）

圖5 甘遂對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性影響（HE染色，×400）Fig.5 Toxic effectsof Radix Kansuion zebrafish larvae（HE stain,×400）

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)首次以斑馬魚(yú)幼魚(yú)為模型，單次給藥，同時(shí)評(píng)價(jià)了甘遂毒性對(duì)機(jī)體心臟、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道等臟器系統(tǒng)的毒性作用及可逆性，并證實(shí)了甘遂可對(duì)肝臟和胃腸道造成實(shí)質(zhì)性損傷，為斑馬魚(yú)模型在中藥毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用提供了參考。

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