張玄，李霄，王權(quán)成，張虹，白鴿，陶開山，竇科峰（空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院肝膽外科，全軍器官移植研究所，陜西 西安 710032）

異種器官移植是未來解決同種器官短缺的有效途徑之一，而豬被認為是最佳異種器官供體。隨著α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶敲除（α-1，3-galactosyltransferase gene knockout，GTKO）豬的逐漸人源化改造，以及新型共刺激信號阻斷劑進入臨床前試驗階段，異種移植的免疫學屏障正不斷被攻克，臨床異種器官移植已經(jīng)離我們越來越近。

與心臟、腎臟移植相比，異種肝移植不僅存在免疫排斥反應(yīng)，更為嚴重的是受體凝血功能調(diào)節(jié)障礙，約90%的受體會出現(xiàn)血循環(huán)中血小板急劇減少，引發(fā)致死性出血。因此，受體的存活時間十分有限（目前的記錄為29天［1］），遠遠無法滿足臨床需求。這和肝臟本身生理功能復(fù)雜，有嚴重的“生理不兼容”等問題有關(guān)。本文將針對異種肝移植中存在的凝血調(diào)節(jié)障礙，圍繞移植過程中出現(xiàn)的血小板激活、聚集和吞噬等免疫生物學問題，特別是血小板和肝血竇內(nèi)皮細胞、肝細胞及庫普弗（Kupffer）細胞之間的相互作用進行論述。

1 豬-猴肝移植時出現(xiàn)嚴重的凝血功能紊亂

最早報道豬-非人靈長類異種肝移植術(shù)后會出現(xiàn)嚴重血小板減少和不可控制出血現(xiàn)象的是Calne教授團隊［2］。研究顯示，這類凝血障礙并不是獨立出現(xiàn)的，往往伴隨著超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）的發(fā)生，這可能與移植中普遍使用野生型豬的肝臟有關(guān)。移植肝臟免疫組織化學會有明顯的IgG、IgM、C3、C4d和C5b-9沉積，同時可觀察到血小板嚴重減少，急性出血性凝固性壞死、可能的梗死和纖維蛋白血栓［3］。2000年，Ramírez等［4］使 用 轉(zhuǎn) 人 CD55分 子（decay accelerating factor，DAF）的基因修飾豬進行異種肝移植后，2只狒狒分別活了4天和8天。2例移植肝臟均未觀察到明顯的HAR發(fā)生，但在術(shù)后第1天即發(fā)生血小板嚴重丟失，同時伴有顯著纖維蛋白原減少和D-二聚體升高，提示出現(xiàn)消耗性凝血功能障礙。在后續(xù)轉(zhuǎn)入人CD59分子和H-transferase后也得到類似結(jié)果，受體存活時間均小于24小時［5］。

2012年，匹茲堡的研究團隊率先進行了GTKO豬-狒狒異種肝移植嘗試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GTKO或GTKO/hCD46豬肝臟配合臨床級別的免疫抑制治療，受體的存活時間可延長到7天，但仍會死于嚴重的血小板減少導致的多組織、器官的自發(fā)性出血［3，6］。研究顯示，血小板減少一般發(fā)生在肝移植術(shù)后1小時，有報道稱狗-豬異種肝移植術(shù)后15分鐘即可觀察到血小板減少［7］，但移植肝功能相對正常，可檢測到豬源凝血因子和白蛋白的表達［8］。組織活檢未發(fā)現(xiàn)有明顯的HAR或急性體液、細胞性排斥反應(yīng)的發(fā)生。免疫組化提示移植肝中有輕度的IgM沉積，未見IgG、C3、C4d及C5b-9沉積和T、B淋巴細胞浸潤。共聚焦顯微鏡和電鏡證實移植肝血竇有大量血小板聚集、血小板-纖維蛋白混合血栓形成及單核/巨噬細胞邊緣浸潤現(xiàn)象［3］。

有學者加強了GTKO豬-狒狒肝移植中免疫抑制治療，可延長受體存活時間到9天。此例實驗中，氨基己酸（賴氨酸的衍生物和類似物，賴氨酸質(zhì)粒結(jié)合位點的有效抑制劑，從而阻斷纖維蛋白溶解）的使用大大緩解了血小板丟失。雖然血小板的減少臨近界值（血小板計數(shù)維持在40 000～50 000/mm3），狒狒仍出現(xiàn)嚴重的出血現(xiàn)象，并最終死于膿毒血癥［9］。

2013年，空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院竇科峰教授團隊在國際上首次嘗試了GTKO豬-藏酋猴脾窩輔助性肝移植研究。實驗過程中，受體的脾臟被切除，部分供體肝臟（約120 g）被植入脾窩，術(shù)后受體存活時間延長至14天。組織學染色證實移植肝中有一定程度的血栓性微血管?。╰hrombotic microangiopathy，TMA）形成，但術(shù)后嚴重血小板丟失現(xiàn)象并未出現(xiàn)，其計數(shù)始終維持在50 000/mm3以上的水平。

2 豬-猴肝移植凝血功能紊亂病理特征

豬-猴肝移植時受體的凝血系統(tǒng)被顯著激活，而豬肝目前缺乏足夠的凝血調(diào)節(jié)能力，最終引發(fā)受體凝血紊亂。其主要病理特征為：TMA和（或）播散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）形成。這兩者均可發(fā)展為血小板減少癥、微血管性溶血性貧血和微血管血栓，最終導致器官缺血、梗塞和功能障礙。研究認為，這與豬內(nèi)皮細胞的激活損傷相關(guān)，搞體和補體介導的內(nèi)皮激活使內(nèi)皮細胞由搞凝狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌隣顟B(tài)。豬源性組織因子（tissue factor，TF）和受體TF的釋放會迅速啟動外源性凝血系統(tǒng)。同時，損傷的內(nèi)皮和暴露的內(nèi)皮下組織會協(xié)同補體系統(tǒng)，共同激活血小板，導致其聚集、黏附和消耗。

多項研究表明，異種肝移植術(shù)后的凝血紊亂是一個多因素、多途徑共同作用的結(jié)果，多種機制均參與其中。單一的處理，如清除天然搞體、中和受體補體等并不能完全阻止其發(fā)生［10］。

3 丟失血小板的去向：聚集、激活或吞噬？

眾所周知，血小板是血管化器官移植存活的重要因素，其通過分泌多種趨化因子和表達相關(guān)受體的配體，如：MIP-1α、 RANTES、 MCP-3和PF4等，影響著單核/巨噬細胞、T細胞和血管內(nèi)皮細胞的交互作用。當巨噬細胞、T細胞和激活的血小板一起定位到血管，通過受體與配體結(jié)合，細胞間的交互作用即開始發(fā)生。激活的血小板表達P-選擇素和CD40L（CD154）。巨噬細胞表達PSGL-1、CD40和MAC-1。除了CD40，巨噬細胞表面的MAC-1也可以和血小板、T細胞表面表達的 CD154 相結(jié)合［11］。

為了更好地研究異種肝移植中血小板聚集、激活或吞噬的相關(guān)問題，許多研究小組建立了豬-非人靈長類的體外研究模型?；虿捎萌搜蜥翎舻难航⒀h(huán)灌注系統(tǒng)來體外灌注豬的肝臟［12］?；蛑苯臃蛛x肝血竇內(nèi)皮細胞和Kupffer細胞進行體外細胞實驗［13］。

3.1 體內(nèi)肝移植研究：匹茲堡的研究小組采用流式檢測分析了GTKO.hCD46供肝移植給狒狒后，受體血細胞-白細胞的黏附聚集情況［6］。研究發(fā)現(xiàn)，嚴重血小板減少癥的進展和血小板自身以及血細胞-白細胞（尤其是單核細胞）的黏附聚集有關(guān)。盡管在整個實驗過程中，平均血小板體積保持穩(wěn)定，但在移植后的第1小時內(nèi)血小板計數(shù)即出現(xiàn)明顯下降。移植后2小時的組織活檢證實，移植肝中有血小板和纖維蛋白的沉積。研究認為，移植后早期受體血循環(huán)中血小板的丟失，部分是由于血小板自身以及血細胞-白細胞之間的黏附聚集造成的，這也是外周血的血小板計數(shù)偏低的原因。血小板在血液、移植肝以及可能在受體肺組織中的聚集均使其無法發(fā)揮正常生理功能，引起自發(fā)性出血［14］。通過共聚焦顯微鏡和電鏡可觀察到肝血竇中血小板的聚集，并伴有外周血單核細胞和纖維蛋白［15］。

他們也同時觀察到肝血竇內(nèi)皮細胞的激活和循環(huán)血小板及外周血單個核細胞的變化。其中，內(nèi)皮細胞的激活分兩種類型，Ⅰ型激活由配體結(jié)合到G蛋白偶聯(lián)受體的胞外段介導，引起P-選擇素的表達和血管中血漿蛋白的滲出，這個過程需要10 ～ 20分鐘［16］。Ⅱ型激活由腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）刺激后誘發(fā)，通過合成黏附蛋白如：E-選擇素和CD106，增加白細胞的募集，這個過程維持6 ～ 24小時［17］。Ⅰ型和Ⅱ型激活被認為分別與HAR和急性體液性異種移植排斥反應(yīng)（acute humoral xenografi rejection，AHXR）有關(guān)［18］。激活的內(nèi)皮細胞和生成的凝血酶進一步激活血小板、白細胞和其他的炎性細胞，形成惡性循環(huán)。

研究發(fā)現(xiàn)，肝移植后2小時，循環(huán)血小板及外周血單個核細胞就已經(jīng)被激活，并開始分泌組織因子CD142。血小板和內(nèi)皮細胞微粒檢測提示血漿中的微粒來源于血小板，呈TF（CD142）陽性。搞豬CD31分子染色提示實驗過程中只有少量的豬內(nèi)皮細胞被激活。同時，通過免疫熒光檢測Ⅰ型（P-selectin）和Ⅱ型（E-selectin、CD106）內(nèi)皮激活，以及TF、von Willebrand因子（vWF）表達，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)皮激活的分子標志以及CD142分子的表達在術(shù)后2小時即顯著降低，但在死亡觀察終點時（4 ～ 7天）仍可見其有表達。組織活檢顯示vWF移植前為陰性，移植后2小時呈陽性，這提示豬源vWF激活了狒狒的血小板［15］，此結(jié)果和Schulte等［19］的報道一致。

Tector等［7］也觀察到血小板的激活和在受體肺組織中的聚集。不論是否有出血現(xiàn)象，受體自身肺組織的血小板染色均呈陽性。但是，受體其他器官（心、腎、小腸和淋巴結(jié)）只有在出現(xiàn)大量間質(zhì)出血時，血小板染色才呈陽性［3］。

3.2 離體血液灌注研究：印第安納波利斯的研究小組使用人血對野生型豬的肝臟進行離體灌注，并在灌注過程的不同時間點（灌注前和灌注15、30、45、90和120分鐘）分別取肝組織活檢。他們發(fā)現(xiàn)肝血竇內(nèi)皮細胞和肝細胞在灌注后15分鐘即開始吞噬人的血小板［12］。馬里蘭的實驗組曾嘗試是否能延緩血小板減少癥的進展，他們利用全身肝素化的狒狒和GTKO.hCD46的豬肝臟建立了體外循環(huán)灌注系統(tǒng)。針對glycoprotein receptor（GP）IbvWF信號通路，灌注前對供豬給予去氨加壓素清除vWF，并在開始灌注時和灌注后30分鐘對受體給予anti-GPIb搞體，他們成功將血小板減少癥延緩至灌注后3小時［20］。

作為肝移植的替代選擇，有研究組建議用豬肝作離體灌注來“橋接”同種肝移植。Rees等［21］用人血灌注豬肝15分鐘即發(fā)現(xiàn)血小板計數(shù)降至30 000/mm3以下，并伴有紅細胞的丟失。在使用野生型豬和hCD55轉(zhuǎn)基因豬的肝臟進行相同的體外灌注72小時后，可觀察到等量的（3 units）人血紅細胞被消耗，這種針對人紅細胞的移植物搞宿主反應(yīng)并不是由經(jīng)典的補體激活溶解途徑引起，而是由肝臟中的Kupffer細胞吞噬造成的，并且這種吞噬和調(diào)理作用無關(guān)［22-23］。

Burlak等［24］認為豬 Kupffer細胞識別人紅細胞是依賴人紅細胞表面的N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-Acetylneuraminic Acid，NANA，Neu5Ac，唾 液酸的一種類型）的表達。在體外細胞實驗中，使用Neu5Ac預(yù)處理Kupffer細胞后，其對紅細胞的結(jié)合明顯減少。這項研究說明去除人紅細胞表面的唾液酸表達可完全廢除Kupffer細胞介導的吞噬效應(yīng)。

了解到人紅細胞表面的低聚糖是導致豬巨噬細胞與人紅細胞相互作用的原因后，Brock等［25］鑒定了豬巨噬細胞表面可能參與此作用的植物凝集素。唾液酸黏附素（sialoadhesin，CD169）被認為介導了豬巨噬細胞和人紅細胞表面Neu5Ac的結(jié)合。此外，體外實驗證實使用搞豬CD169單克隆搞體預(yù)處理豬的Kupffer細胞可降低其與人紅細胞的結(jié)合率，達到和同種移植相同的水平。Waldman等［26］也利用分離的人紅細胞灌注野生型豬的肝臟72小時，同時使用搞豬CD169單克隆搞體，發(fā)現(xiàn)紅細胞的破壞明顯減少，肝功能也得到改善。

3.3 體外細胞干預(yù)研究：肝臟是補體蛋白的合成位點，除外C1q、D因子及備解素和C7。異種肝移植后，移植物將合成豬源補體蛋白。豬補體不會對移植肝造成損傷，特別是在GTKO豬表達hCD46分子或其他人補體調(diào)節(jié)蛋白的情況下。匹茲堡的研究小組證實［27］，相對于人補體，豬補體對移植肝的損傷小得多。異種肝移植后，總體的補體活性基本保持穩(wěn)定或有所升高。他們還證實，GTKO.hCD46豬來源的外周血單個核細胞會發(fā)生較少的補體或搞體介導的溶細胞效應(yīng)。

在體外灌注實驗中證實了血小板是被豬肝血竇內(nèi)皮細胞、Kupffer細胞和肝細胞吞噬之后，印第安納波利斯的研究團隊進一步探索了引起血小板減少的受體-配體相互作用。他們將注意力放在了脫唾液酸糖蛋白受體-1（asialoglycoprotein receptor-1，ASGR1）的作用上，該蛋白參與了血小板的清除過程。分別分離野生型和GTKO.hCD55豬的肝血竇內(nèi)皮細胞和帶有熒光標記的人血小板進行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ASGR1與血小板吞噬產(chǎn)生共定位，使用去唾液酸糖蛋白和ASGR1特異性搞體可抑制血小板的結(jié)合和吞噬，并呈劑量依賴性。同時，使用siRNA降低肝血竇內(nèi)皮細胞ASGR1的表達，血小板的吞噬效率會降低21%～31%左右［28］。

Kupffer細胞是肝臟巨噬細胞，同樣參與了血小板的吞噬過程。CD11b/CD18（MAC-1）是和吞噬相關(guān)的受體。印第安納波利斯課題組研究了CD11b/CD18在野生型和GTKO.hCD55豬源Kupffer細胞吞噬人血小板過程中的作用［29］。當吞噬發(fā)生時，CD18和血小板產(chǎn)生共定位，搞CD18單克隆搞體可抑制這種吞噬作用，在野生型和GTKO.hCD55型Kupffer細胞中的抑制效率分別為43%～73%和18%～55%。波士頓的研究小組通過分離野生型和GTKO豬的肝細胞和肝血竇內(nèi)皮細胞，探索了整合素依賴的狒狒血小板的激活和吞噬，他們發(fā)現(xiàn)豬源肝血竇內(nèi)皮細胞對豬的血小板不發(fā)生吞噬作用，但是會對狒狒的血小板發(fā)生強烈的吞噬效應(yīng)。雖然豬源肝血竇內(nèi)皮細胞和主動脈內(nèi)皮細胞均吞噬狒狒血小板（肝血竇內(nèi)皮的吞噬作用更強），但體外未發(fā)現(xiàn)豬肝細胞對血小板的吞噬作用［30］。有研究發(fā)現(xiàn)，人類血小板Galβ和βGlcNAc半乳糖的暴露程度是新鮮豬血小板的4倍，Galβ和βGlcNAc在豬血小板上不被唾液酸所掩蓋，從人類血小板中去除唾液酸會增加肝血竇內(nèi)皮細胞和Kupffer細胞的結(jié)合和吞噬作用［13］。

4 凝血障礙相關(guān)干預(yù)方案

4.1 信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory protein-α，SIRPα）-CD47：肝臟巨噬細胞（Kupffer細胞）和肝血竇內(nèi)皮細胞表達SIRPα，它能使細胞分清自我和非我從而調(diào)控吞噬作用。CD47是SIRPα識別自我的蛋白分子，在紅細胞和血小板上均有表達，正常情況下，SIRPα-CD47的相互作用可以防止吞噬。研究表明人SIRPα可和豬CD47分子結(jié)合，甚至表現(xiàn)出更高的親和力，但卻無法發(fā)揮出抑制吞噬的作用。豬SIRPα和人CD47分子之間也存在種屬不兼容問題，兩者相互作用不能抑制豬源細胞對人血小板的吞噬。盡管理想的基因改造方法是使豬的肝臟表達人SIRPα，但是人SIRPα和豬CD47分子的親和力遠高于人CD47，無法產(chǎn)生抑制酪氨酸磷酸化的信號。同時，人SIRPα和內(nèi)源豬SIRPα之間還會產(chǎn)生競爭關(guān)系，使情況變得更為復(fù)雜［31］。

SIRPα不僅表達在肝臟內(nèi)皮細胞和Kupffer細胞，循環(huán)巨噬細胞同樣有表達，因此，循環(huán)巨噬細胞同樣需要內(nèi)皮或其他細胞提供CD47信號來防止被激活。Zhang等［32］和Tena等［33］分別報道繁育出導入人CD47的小型豬，但是進行異種肝移植后的結(jié)果卻不盡如人意。這可能與CD47介導炎癥反應(yīng)和增強血管收縮功能有關(guān)，因此，CD47的過表達對移植物本身可能是有害的。此外，CD47還是血小板反應(yīng)素-1（thrombospondin-1，TSP-1）的受體，而TSP-1在血小板聚集和血栓形成中發(fā)揮重要作用［34］。

4.2 血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）：豬的血栓調(diào)節(jié)蛋白很難激活人凝血酶，導致活化型的人蛋白C（active protein C，aPC）生成減少。目前世界上已有許多研究成功培育出表達人源TM（hTM）的小型豬。已有的體外證據(jù)和轉(zhuǎn)基因小鼠實驗表明，hTM的表達對調(diào)節(jié)異種移植過程中的凝血功能障礙和炎癥有益［35］。目前，匹茲堡的研究團隊利用GTKO/hCD46/hTM和GTKO/hCD55/hCD59/hCD39/hTM兩種類型的轉(zhuǎn)基因豬，在異種心臟移植中證實，導入hTM可以維持血小板和纖維蛋白原的穩(wěn)定，血小板的激活明顯減弱，消耗性凝血障礙得到緩解。盡管這些體內(nèi)研究結(jié)果非常鼓舞人心，為跨物種不兼容相關(guān)凝血障礙提供了可能的解決途徑，但是，在此基礎(chǔ)上再導入內(nèi)皮細胞蛋白C受體可能效果會更顯著。

4.3 組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）：TF 又稱為血小板組織因子（platelet tissue factor）、因子Ⅲ和CD142，在內(nèi)皮下組織和白細胞均有表達，在凝血過程中的作用是啟動外源性凝血途徑，促進血栓生成。TFPI是一種單鏈多肽，它可以可逆地抑制因子Xa（FXa）。當FXa被抑制時，F(xiàn)Xa-TFPI復(fù)合體也可以抑制FⅦa-TF復(fù)合體，抑制外源性凝血過程。生理情況下，TF和TFPI兩者處于動態(tài)平衡。早期的證據(jù)證實豬的TFPI和人的FXa不兼容，然而，后來有體外研究證實，合適糖基化修飾的重組豬源TFPI和人TF途徑?jīng)]有明顯的不兼容現(xiàn)象。最近，西安的竇科峰教授課題組在豬的骨髓間充質(zhì)干細胞中導入人的TFPI，發(fā)現(xiàn)其能夠通過人TF途徑調(diào)節(jié)凝血異常［36］。另外，豬的內(nèi)皮細胞表達人TFPI是有益的，因為TFPI會迅速地由炎性血管內(nèi)皮脫落。目前，世界上僅培育出胰腺特異性表達TFPI的小型豬，對于肝臟而言，將來TFPI的表達最好局限在血管內(nèi)皮細胞，因為TFPI的過表達可能對豬的存活不利。

4.4 三磷酸腺苷二磷酸水解酶-1（CD39）/胞外核苷酸酶（CD73）：膜外CD39分子參與了ATPADP-AMP的分解過程。CD73分子負責催化AMP水解成腺苷（一種搞血栓和心血管保護的介質(zhì)）。Dwyer等最早報道，在小鼠中轉(zhuǎn)入人的CD39（hCD39）分子可以使其血小板聚集功能受損，延長出血時間，減少系統(tǒng)性血栓栓塞的發(fā)生［37］。Wheeler等［38］的研究表明，在豬中導入 hCD39 分子，發(fā)現(xiàn)能明顯保護心肌。有研究顯示，敲除CD73分子對體內(nèi)血栓形成影響很小，但是增加造血來源細胞表面CD39分子的表達（特別是單核細胞），會明顯延緩動脈血栓形成［39］。在豬到非人靈長類的異種腎移植大動物研究中，GTKO/ hCD55/hCD59/hCD39的轉(zhuǎn)基因豬并沒有帶來令人鼓舞的結(jié)果［40］。

4.5 von Willebrand因子（vWF）：豬vWF可以激活受體狒狒的血小板，有證據(jù)表明，敲除豬vWF后需要同時導入人vWF，因為vWF敲除豬有出血傾向。但是，由于vWF基因復(fù)雜且定位較寬，使豬表達人vWF是十分困難的。Schulte Am Esch教授證實了豬vWF和人血小板GPIb受體的種間功能不兼容，因此，可以嘗試選擇性的調(diào)控豬vWF在個體化GPIb的結(jié)合位點。血小板vWF受體的唾液酸表達水平不同會導致脫唾液酸的水平也不同，這會增加血小板的清除，此過程在異種肝移植中會尤為明顯。

4.6 人凝血酶原復(fù)合物（human prothrombin concentrate complex，hPCC）：針對豬到非人靈長類異種肝移植中血小板減少導致的致死性出血問題，美國麻省總院的肝移植團隊，在2例GTKO-狒狒的肝移植過程中持續(xù)輸注了外源性的hPCC，并測定了血循環(huán)中維生素K依賴凝血因子和非維生素K依賴凝血因子的活動度，提示移植肝臟有新生凝血因子生成，受體出血異常得到明顯改善。最后，2例受體的存活時間分別延長至 25［41］和 29 天［1］。

5 小 結(jié)

總之，關(guān)于改善豬-猴異種肝移植過程中凝血功能調(diào)節(jié)障礙的各種策略作用均是有限的，因此，多種途徑聯(lián)合可能有更顯著的效果。在目前基本克服了HAR和急性血管性排斥反應(yīng)之后，我們有理由相信，如果嚴重的血小板丟失也能夠被克服，凝血調(diào)節(jié)障礙能進一步被有效控制，那么異種肝移植的臨床應(yīng)用（特別是對急性暴發(fā)性肝臟功能衰竭患者進行“橋接”治療）將會變得越來越近。