王呈玉+張浩+崔俊濤+焉莉+王玉軍+王繼紅+王艷紅

摘要：為開(kāi)發(fā)防病促生生物菌肥種質(zhì)資源，采用對(duì)峙培養(yǎng)法從人參根際土壤中分離具有拮抗植物病原真菌活性的放線(xiàn)菌，鑒別培養(yǎng)基篩選，結(jié)合分光光度計(jì)法，定性定量測(cè)定其產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、溶磷和產(chǎn)鐵載體等促生活性，并對(duì)該放線(xiàn)菌進(jìn)行生理生化和分子鑒定。結(jié)果表明，獲得1株具有較強(qiáng)植物病原真菌拮抗活性的放線(xiàn)菌菌株，與淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae）的親緣關(guān)系最近，將其命名為淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A；同時(shí)該菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體促生活性，可以為后續(xù)防病促生菌劑的研制提供新的材料。

關(guān)鍵詞：植物根際促生菌；吲哚乙酸；溶磷作用；鐵載體；分子鑒定；拮抗活性

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.675文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0103-04

植物根際促生菌是土壤中的重要組成部分，它們直接或間接地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，參與土壤各種營(yíng)養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)和可持續(xù)的農(nóng)作物生產(chǎn)[1，3]。植物根際促生菌通過(guò)在植物根際土壤中協(xié)助植物獲取營(yíng)養(yǎng)元素、動(dòng)員土壤中難溶性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、分泌植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和抗病活性物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抑制植物病害的發(fā)生[1，3-13]。因此，篩選各種植物根際促生菌，并對(duì)其防病促生活性進(jìn)行研究，可以為PGPR菌劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供優(yōu)質(zhì)的菌種材料，從源頭上減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)化學(xué)肥料和農(nóng)藥的依賴(lài)，創(chuàng)造可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境。

從人參根際土壤中分離得到1株具有較強(qiáng)生物防治功能的放線(xiàn)菌淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A（Streptomyces lavendulae strain DC-A），該菌還具有產(chǎn)吲哚乙酸（indoleacetic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)IAA）、溶解無(wú)機(jī)磷和產(chǎn)生鐵載體的促生活性，可為開(kāi)發(fā)人參專(zhuān)用型PGPR菌劑提供優(yōu)良的菌種，從而解決人參種植過(guò)程中由于農(nóng)藥的施用導(dǎo)致的人參品質(zhì)下降問(wèn)題。

1材料與方法

1.1土壤樣本的來(lái)源

采集吉林省集安市和撫松市人參主產(chǎn)區(qū)人參根際土壤，放入自封袋中，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2供試病原菌來(lái)源

人參立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、人參菌核病菌（Sclerotinia libertiana Fuck.）、人參枯萎病菌（F. oxysporum）、人參根腐病菌（Fusarium solani）、人參黑斑病菌（Alternaria panax）、禾谷鐮孢菌（F. graminearum）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、黃瓜枯萎病菌（F. oxysporium f.sp.cucumerinum）、串珠鐮孢菌（F. moniliforme）、玉米彎孢葉斑病菌（Curvularia lunata）、番茄灰霉病菌（Botrytis cirerea）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora var.carotovora）、十字花科蔬菜黑腐病菌（Xanthomonas campestris var.campestris）、茄科青枯病菌（Ralstonia solanacearum）。以上菌株均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3人參根際土壤具有拮抗活性的放線(xiàn)菌的篩選

稱(chēng)取10 g人參根際土壤，采用稀釋平皿分離法，在放線(xiàn)菌分離培養(yǎng)基（可溶性淀粉20.00 g，KNO3 1.00 g，NaCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，K2HPO4·3H2O 0.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18.00 g，蒸餾水1 L，pH值7.5～8.0。）表面分離土壤中的放線(xiàn)菌；經(jīng)純化后的放線(xiàn)菌菌株，于-20 ℃（用甘油保存）和4 ℃冰箱中保存。

以16種引起植物病害的病原真菌為指示菌，采用對(duì)峙培養(yǎng)法，篩選具有拮抗活性的放線(xiàn)菌。在PDA培養(yǎng)基表面一端接種指示菌，另一端接種人參根際放線(xiàn)菌，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，培養(yǎng)至病原菌長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)結(jié)束，以抑菌帶寬度確定放線(xiàn)菌的拮抗活性。以不接放線(xiàn)菌的平板作對(duì)照。

1.4人參根際放線(xiàn)菌促生活性檢測(cè)

1.4.1產(chǎn)IAA活性的定性和定量測(cè)定采用Salkowski比色法對(duì)具有拮抗活性的人參根際放線(xiàn)菌進(jìn)行產(chǎn)IAA活性測(cè)定。將放線(xiàn)菌分別接種于含L-色氨酸終濃度為0.5、1.0 g/L 的高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)，14 d后吸取5 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，吸取4 mL上清加入等體積的Salkowski顯色劑，充分混勻，室溫避光顯色 30 min，出現(xiàn)粉色為陽(yáng)性，說(shuō)明具有產(chǎn)IAA活性[14]?？焖賹⒎磻?yīng)液在530 nm處測(cè)定吸光度（D530 nm）。以不添加色氨酸的培養(yǎng)基為對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)品IAA對(duì)應(yīng)的光密度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算IAA的產(chǎn)量（mg/L）。

1.4.2溶磷活性的測(cè)定將具有拮抗活性的人參根際放線(xiàn)菌接種于液體高氏1號(hào)培養(yǎng)基，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)7 d，8 000 r/min 離心5 min收集菌體，用去離子水重懸菌體沉淀后 8 000 r/min 離心5 min，每次操作重復(fù)3次，將菌體表面的高氏1號(hào)培養(yǎng)基成分洗凈，無(wú)菌操作稱(chēng)取0.3 g菌體（濕質(zhì)量）接種于100 mL PKO液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)14 d，采用鉬銻抗比色法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液有效磷含量，對(duì)具有拮抗活性的人參根際放線(xiàn)菌進(jìn)行溶磷活性測(cè)定[15]。以不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.4.3產(chǎn)鐵載體活性的定性分析將具有拮抗活性的人參根際放線(xiàn)菌接種于CAS培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)14 d，觀察菌落周?chē)欠裼型该魅16]。

1.5人參根際促生放線(xiàn)菌的鑒定endprint

1.5.1人參根際促生放線(xiàn)菌的培養(yǎng)特征和生理生化特性鑒定采用插片法觀察人參根際促生放線(xiàn)菌菌絲體形態(tài)，并參照范麗霞等的方法[17]，采用國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃培養(yǎng)基（ISP），將溶磷放線(xiàn)菌菌株分別接種到酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基（ISP2）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP3）、無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP4）、甘油天門(mén)冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基（ISP5）、蛋白胨酵母膏鐵鹽瓊脂培養(yǎng)基（ISP6）、酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基（ISP7）、察氏培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)20 d，觀察并記錄菌株在7種不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。

參照徐麗華等的方法[18]進(jìn)行人參根際促生放線(xiàn)菌的生理生化特征鑒定。

1.5.2人參根際促生放線(xiàn)菌的分子鑒定將具有防病促生活性的人參根際放線(xiàn)菌接種于高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)7 d，離心收集菌體后抽真空冷凍干燥48 h。冷凍干燥后的菌體，提取基因組DNA。參照Hamdali等的方法[19]進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，用Clustal W將測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA 6.0軟件對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用Bootstrap法（1 000 次重復(fù)）檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1人參根際放線(xiàn)菌抑菌譜的測(cè)定

對(duì)分離到的人參根際放線(xiàn)菌進(jìn)行培養(yǎng)皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)，獲得1株對(duì)病原真菌具有較強(qiáng)拮抗活性的放線(xiàn)菌菌株，命名為DC-A。由圖1可以看出，菌株DC-A對(duì)禾谷鐮孢菌、人參菌核病菌、人參枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、人參黑斑病菌和人參根腐病菌具有較強(qiáng)的抑菌效果，其抑菌帶寬度分別為 10.1、19.6、7.5、5.8、8.2、4.2 mm。

2.2人參根際放線(xiàn)菌促生活性檢測(cè)

2.2.1菌株DC-A產(chǎn)IAA活性的定性和定量測(cè)定結(jié)果由圖2可知，人參根際放線(xiàn)菌DC-A具有合成IAA的能力。IAA含量隨L-色氨酸（L-trp）添加濃度的增大而增大，不添加色氨酸時(shí)，菌株DC-A的IAA合成量最高達(dá)4.96 mg/L；色氨酸添加濃度為0.05%、0.10%時(shí)，菌株DC-A合成IAA的量明顯高于對(duì)照組，最高合成量分別為15.36、33.59 mg/L。

2.2.2菌株DC-A溶無(wú)機(jī)磷活性測(cè)定由圖3可知，人參根際放線(xiàn)菌菌株DC-A在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的PKO液體培養(yǎng)基中，具有明顯的溶磷特性，15 d內(nèi)菌株的溶磷量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在12 d前溶磷量呈明顯增加趨勢(shì)，在12 d達(dá)到最高溶磷量410.95 mg/L。相應(yīng)發(fā)酵液的pH值并沒(méi)有同溶磷量表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的趨勢(shì)，而是在pH值為7.0上下波動(dòng)。由此可以看出，人參根際放線(xiàn)菌菌株DC-A在以Ca3（PO4）2為唯一磷源的PKO液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)的明顯溶磷特性與發(fā)酵液pH值變化不相關(guān)，菌株DC-A的溶磷機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.2.3菌株DC-A產(chǎn)鐵載體活性鑒定由圖4可知，將人參根際放線(xiàn)菌DC-A接種于CAS固體平板培養(yǎng)14 d后，在其菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯的橙紅色顏色圈，說(shuō)明人參根際放線(xiàn)菌DC-A具有合成鐵載體的活性。

2.3人參根際促生菌株DC-A的鑒定

2.3.1菌株的形態(tài)特征菌株DC-A在固體高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，氣絲絨狀，淺灰色至灰色?；z粉紫色、紅紫色和紫色，可溶色素同基絲色。氣生菌絲發(fā)達(dá)，孢子絲螺旋形，可達(dá)10圈，呈現(xiàn)典型的鏈霉菌形態(tài)特征，結(jié)果如圖5所示。

2.3.2菌株的培養(yǎng)特征高氏合成1號(hào)瓊脂：氣絲灰色，絨狀，基絲粉紫色。酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基（ISP2）：氣絲豐茂，灰粉色帶薰衣草色彩，基絲豐茂，無(wú)色至弱褐色，可溶色素櫟褐色。燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（ISP3）：氣絲灰粉色帶薰衣草色彩，基絲無(wú)色，無(wú)可溶色素。無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂（ISP4）：氣絲豐茂，黃灰色，基絲無(wú)色，可溶色素黃色。甘油天門(mén)冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基（ISP5）：氣絲弱，褐灰色至銀灰色，基絲好，無(wú)色，無(wú)可溶色素。蛋白胨酵母膏鐵鹽瓊脂培養(yǎng)基（ISP6）：氣絲不發(fā)達(dá)，灰粉色帶薰衣草色，基絲好，無(wú)色，可溶色素弱褐色。酪氨酸瓊脂（ISP7）：氣絲豐茂，紅灰色帶薰衣草色彩，基絲好，弱褐色至芥褐色，可溶色素?zé)o至弱褐色。察氏培養(yǎng)基：氣絲弱，灰色，基絲好，無(wú)可溶色素。結(jié)果如圖6所示。

2.3.3菌株的生理生化特性生理生化試驗(yàn)表明，菌株 DC-A 能使明膠液化、牛奶凝固并胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、纖維素水解、在蛋白胨酵母精鐵瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂內(nèi)產(chǎn)生褐色素，但不產(chǎn)生硫化氫（H2S）、黑色素。碳源利用結(jié)果顯示，菌株利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、蔗糖以及麥芽糖、醋酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉；對(duì)D-果糖和D-木糖利用較差；不利用棉子糖、肌醇、D-甘露醇、L-鼠李糖以及L-乳糖。

2.3.4菌株的16S rDNA鑒定參照Hamdali等的方法[19]，以菌株DC-A總DNA為模板，對(duì)DC-A菌株的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1 418 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中利用Blast軟件進(jìn)行同源性序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖7所示。菌株DC-A與已報(bào)道的淡紫灰鏈霉菌親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)99%，與Blast結(jié)果一致。因此，菌株DC-A在分類(lèi)學(xué)地位上初步確定為淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A。

3結(jié)論與討論

綜上所述，從人參根際土壤中分離得到1株具有抗多種植物真菌病害功能的放線(xiàn)菌淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A。該菌兼具產(chǎn)IAA、鐵載體和溶解無(wú)機(jī)磷的功能。淡紫灰鏈霉菌菌株DC-A為人參根際專(zhuān)用防病促生菌劑的開(kāi)發(fā)提供了優(yōu)

質(zhì)的資源。

致謝：研究中所用植物病原真菌均來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室，特此表示感謝。

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