稅典章， 陳勝峰， 吳萍， 葉元土， 陳佳， 張晶晶

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123)

異育銀鯽是以天然雌核發(fā)育的方正銀鯽Carassiusauratusgibelio(Bloch)為母本、興國紅鯉Cyprinuscarpiovar.singuonensis為父本，經(jīng)異精雌核發(fā)育得到的子代(徐文斌，孫曉波，1993)。它具有生長迅速、食性廣泛、捕撈容易、耐低氧、繁殖方便和經(jīng)濟(jì)價值高等優(yōu)點(diǎn)，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中顯示出良好的經(jīng)濟(jì)性狀(潘庭雙等，2001)，其養(yǎng)殖業(yè)在淡水漁業(yè)中占據(jù)十分重要的地位(陳靜等，2014)。然而近年來，因感染鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirusⅡ， CyHV-2)導(dǎo)致的鰓出血病，嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，某些染病塘口的死亡率甚至高達(dá)100%(張晗，2014)。了解異育銀鯽的非特異性免疫及免疫防御機(jī)制，是提高異育銀鯽抗病能力的基礎(chǔ)。進(jìn)行異育銀鯽Prx基因的研究，不僅可為研究其先天免疫反應(yīng)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，也可為研究其他魚類的抗病機(jī)制提供借鑒。

本研究從異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果中鑒定了Prx基因的部分序列，利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆了其cDNA全長，預(yù)測了蛋白質(zhì)序列、進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析；研究了異育銀鯽過氧化物還原酶(CaPrx)基因的組織表達(dá)特征，并比較了它在健康和感染CyHV-2的異育銀鯽體內(nèi)的表達(dá)差異，以期為異育銀鯽的健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗魚健康的異育銀鯽由江蘇省東臺市林華水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司提供，二夏齡，體質(zhì)量為98～188 g，共120尾，其中雌魚70尾。自然發(fā)病的魚體由江蘇省大豐市華辰水產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司提供，二夏齡，體質(zhì)量89～141 g，共36尾，其中雌魚22尾。病魚全身發(fā)黑，背鰭和尾鰭末端發(fā)白，眼球充血突出，肌肉充血，鰓呈鮮紅色，鰓絲出血，在鰓絲末端有紅色斑塊。抽取健康魚血液，解剖取出鰓、腸道、肝臟、脾臟、頭腎、中腎、表皮和肌肉等組織；解剖病魚并取出肝臟和脾臟。上述組織在DEPC水配制的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中漂洗后，經(jīng)液氮冷凍，于-80 ℃保存，用于總RNA提取。

1.1.2試劑大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖購自Invitrogen；DEPC購自上海生工生物公司；PrimeScriptTMRTase逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、pMD19-T載體、Trizol、DNA聚合酶Ⅰ、SYBR Premix Ex Taq、dNTP、rTaq酶、DNA Marker購自TaKaRa；SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒購自Clontech。

1.2 患病魚體的鑒定

根據(jù)CyHV-2病毒序列(KM200722.1)設(shè)計引物CyHV-2-F、CyHV-2-R(表1)，以病魚各組織DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系如下：滅菌蒸餾水16.2 μL、rTaq酶0.3 μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、2.5 mM dNTP Mixture2 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物(10 μM)各1 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智科技有限公司測序，序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BlastX比對分析。

1.3 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

取-80 ℃保存的各組織樣品于液氮中研磨，參照Trizol使用說明書進(jìn)行總RNA提取。用DNase Ⅰ對RNA進(jìn)行消化處理，所得RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照PrimeScriptTMRT 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成cDNA的第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CaPrx基因、β-actin基因核心序列的克隆

根據(jù)本實(shí)驗室異育銀鯽轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果所鑒定的Prx基因、β-actin基因cDNA序列設(shè)計引物Prx-F、Prx-R、actin-F和actin-R(表1)。以異育銀鯽肝臟cDNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增CaPrx、β-actin基因。25 μL反應(yīng)體系如下：滅菌蒸餾水16.2 μL、rTaq酶0.3 μL、10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、2.5 mM dNTP Mixture 2 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物(10 μM)各1 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 40 s、57 ℃40 s、72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑選單克隆送蘇州金唯智科技有限公司測序，所得cDNA片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BlastX同源性分析。

1.5 CaPrx基因全長cDNA序列的獲得

根據(jù)上述克隆測序獲得的CaPrx基因cDNA片段序列，設(shè)計3’RACE引物3-Prx-inner、3-Prx-outer和5’RACE引物5-Prx-inner、5-Prx-outer(表1)。以異育銀鯽肝臟總RNA為模板，根據(jù)SMARTTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說明書分別合成3’-RACE-Ready cDNA和5’-RACE-Ready cDNA。分別以3’-RACE-Ready cDNA和5’-RACE-Ready cDNA為模板，以引物UPM和基因特異outer引物進(jìn)行首輪PCR擴(kuò)增，電泳檢測并將PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，以引物NUP和基因特異inner引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序方法同1.4。

1.6 CaPrx基因的同源性對比、全長cDNA序列特征分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

用Vector NTI Suite對獲得的cDNA序列進(jìn)行拼接。使用NCBI的ORF Finder對獲得的序列作開放閱讀框(ORF)分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，預(yù)測編碼氨基酸序列。通過NCBI BlastP(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源性分析。異育銀鯽Prx蛋白與其他物種氨基酸序列的比較使用Clustal W多序列對比和BioEdit分析。用MEGA 6.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分子節(jié)點(diǎn)支持率采用1 000次重復(fù)抽樣檢測。利用PROTPARAM(http：//expasy.org/tools/protparam.html)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，信號肽的預(yù)測使用Signal P(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。

1.7 異育銀鯽不同組織中CaPrx基因的mRNA表達(dá)

以1.3中獲得的不同組織的cDNA稀釋10倍為模板，以獲得的CaPrx基因設(shè)計特異引物Prx-q-F和Prx-q-R，以本研究獲得的異育銀鯽β-actin基因序列(NCBI登錄號：MF463002)設(shè)計內(nèi)參引物actin-q-F和actin-q-R(表1)。以無菌水作為陰性對照。20 μL反應(yīng)體系為：滅菌蒸餾水6 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，稀釋的cDNA樣本2 μL，8 μM的上、下游引物各1 μL。實(shí)驗儀器為LineGene9600熒光定量PCR儀。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 2 s，共40個循環(huán)；熔解段95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。每次反應(yīng)都通過從95 ℃降至60 ℃(4 ℃/s)繪出熔解曲線。反應(yīng)結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析(Livak & Schmittgen，2001)。用SPSS處理數(shù)據(jù)。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primer used in this study

1.8 CyHV-2人工感染異育銀鯽及CaPrx基因的mRNA表達(dá)

實(shí)驗前取患病異育銀鯽的內(nèi)臟組織按1∶6(w/v)0.75%滅菌生理鹽水制作組織勻漿，-80 ℃至室溫反復(fù)凍融3次，5 000 r·min-1離心10 min，所得上清液過0.45 μm濾膜除菌后，收集濾液置于4 ℃?zhèn)溆?劉文枝等，2013)。每尾魚腹腔注射0.3 mL病毒液，對照組每尾注射0.3 mL生理鹽水，每組設(shè)3個平行處理。攻毒實(shí)驗完成后12 h、24 h和48 h采樣，取肝臟和脾臟組織，在DEPC水配制的PBS中漂洗后，經(jīng)過液氮冷凍，于-80 ℃保存。提取RNA后，經(jīng)過DNaseⅠ消化，電泳，用于cDNA的合成。具體參見1.3。得到的cDNA用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測抗氧化還原酶基因的表達(dá)，方法同1.7。

2 結(jié)果

2.1 異育銀鯽感染CyHV-2的鑒定

患病異育銀鯽組織樣本以CyHV-2-F、CyHV-2-R為引物，PCR結(jié)果呈陽性，獲得了239 bp的特異性條帶(圖1)，測序結(jié)果經(jīng)BlastX比對，確定其與CyHV-2 DNA解旋酶序列完全一致，表明病魚感染了CyHV-2。

圖1 感染CyHV-2異育銀鯽的PCR檢測Fig. 1 PCR assay of Carassius auratus gibelioinfected with CyHV-2

M. DL2000 Marker， 1～4. 病魚樣品the diseased fish， 5～8. 健康魚樣品the healthy fish

2.2 CaPrx基因的克隆

以異育銀鯽肝臟cDNA為模板，以Prx-F和Prx-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得591 bp的PCR產(chǎn)物，克隆測序后，結(jié)果經(jīng)BlastX分析確定為CaPrx基因目的片段。5’端和3’端經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到特異性條帶，條帶分別長328 bp和700 bp(圖2)。對其進(jìn)行克隆、測序，測序結(jié)果經(jīng)分析拼接后，獲得CaPrx基因的全長cDNA序列(GenBank登錄號：MF346707)。

2.3 CaPrx基因全長序列特征

CaPrx基因cDNA序列全長1 035 bp，ORF長594 bp，位于76～669 bp處；5’非編碼區(qū)長75 bp，3’非編碼區(qū)長366 bp，共編碼197個氨基酸；預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量為21.83 kD，理論等電點(diǎn)為5.93。3’非編碼區(qū)中具有典型的加尾信號AATAAA(圖3)。

圖2 異育銀鯽Prx基因RACE電泳圖Fig. 2 RACE of Prx gene from Carassius auratus gibelio

A. 5’-RACE ofPrxgene， B. 3’-RACE ofPrxgene， M. DL2000 Marker， 1. 5’-Prx-inner， 2. 3’-Prx-inner

通過NCBI Conserved Domain Search搜索分析，CaPrx蛋白氨基酸有一個保守結(jié)構(gòu)域PRX_Typ2cys(8～179)，屬于Thioredoxin_like superfamily超蛋白家族。CaPrx基因翻譯的蛋白無信號肽，在氨基酸序列的N端和C端各有1個保守的半胱氨酸(Cys)殘基，位于保守的“FYPLDFTFVCPTEI”和“GEVCPA”序列中。

2.4 CaPrx基因的同源性比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3CaPrx基因cDNA全長以及推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig. 3 Nucleotide (upper row) and deduced amino-acid (lower row) sequences ofCaPrxfull-length cDNA

起始密碼子、終止密碼子和加尾信號用下劃線標(biāo)出， 保守序列用方框標(biāo)出， 保守Cys用陰影顯示

The predicted start codon (ATG)， stop codon and the polyadenylation signal sequence (AATAAA) are indicated with underline， conserved sequences are indicated with shadows， the conserved Cys in the sequence is indicated with shadows

圖4 Prx蛋白的氨基酸多序列對比Fig. 4 Alignment of the deduced amino acid sequences of Prx

陰影表示序列中絕對保守或高度保守的氨基酸 the shadows represent conserved amino acids in the proteins， Prx的保守序列用方框顯示 conserved sequences of Prx are indicated with boxes， 本實(shí)驗所得異育銀鯽Prx用下劃線標(biāo)出 Prx ofCarassiusauratusgibelioin this study is indicated with underline； 登錄號GenBank accession numbers： 鯽Carassiusauratus(AGO58900.1)， 印度明對蝦Fenneropenaeusindicus(ACS91344.1)， 三疣梭子蟹Portunustrituberculatus(ACI46625.1)， 黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(NP_477510.1)， 絨啄木鳥Picoidespubescens(KFV68516.1)， 獅鬃水母Cyaneacapillata(AHL38196.1)， 褐家鼠Rattusnorvegicus(NP_476455.1)， 異育銀鯽Carassiusauratusgibelio(MF346707)

圖5 基于Prx氨基酸序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from the amino acid sequences of Prx

2.5 CaPrx基因的組織表達(dá)特征

以β-actin基因為內(nèi)參，以肝臟的基因表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，CaPrxmRNA在肝臟、血細(xì)胞、脾臟、肌肉、心臟和中腎等組織中均有表達(dá)(圖6)，是一種廣泛表達(dá)的基因。其中，在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，約為肝臟表達(dá)量的1.1倍，其次是肝臟。在腸道和肌肉中也有較高表達(dá)，分別為肝臟表達(dá)量的80%和65%。而在其他組織中的表達(dá)量明顯低于肝臟和血細(xì)胞。其中，在鰓和頭腎中的表達(dá)量最少，約為肝臟表達(dá)量的10%。此外，在脾臟、心臟、腦、中腎和表皮中也有表達(dá)。

2.6 異育銀鯽人工感染CyHV-2后CaPrx基因的表達(dá)變化

健康的異育銀鯽在人工感染CyHV-2后，CaPrxmRNA在肝臟和脾臟中均出現(xiàn)了差異性表達(dá)。在感染12 h后，肝臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量顯著上升，約為健康魚的3倍(P<0.05)，24 h時急劇下降至略低于健康時的水平，48 h時降至更低點(diǎn)，與自然發(fā)病魚體內(nèi)的CaPrxmRNA表達(dá)量持平。與健康異育銀鯽相比，自然患病的CaPrxmRNA的表達(dá)量幾乎下降了80%。與CaPrxmRNA在肝臟中的表達(dá)情況不同，異育銀鯽在人工感染病毒后，脾臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量在12 h、24 h、48 h均顯著下降。相較于病毒感染后2 d內(nèi)脾臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量，自然發(fā)病的異育銀鯽脾臟中CaPrxmRNA的表達(dá)量有所上升(圖7)。

3 討論

3.1 CaPrx的結(jié)構(gòu)與功能

Prx屬于抗氧化蛋白超家族，廣泛存在于原核生物和真核生物中。該家族所有蛋白均在N端具有保守的Cys殘基，有的成員在C端還具有保守的Cys。根據(jù)其保守Cys的數(shù)目，可以分為2個亞家族，即1-Cys Prx和2-Cys Prx家族(Hofmanetal.，2002；Muetal.，2009)。CaPrx氨基酸序列的N-端和C-端各有1個保守的Cys殘基，這是2-Cys Prx家族中Prx所特有的結(jié)構(gòu)，這2個Cys殘基在Prx的催化功能中具有關(guān)鍵作用。以上特征說明CaPrx基因?qū)儆?-Cys Prx家族。2-Cys Prx家族基因已被證明參與過氧化氫在真核生物的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑(Kangetal.，2005；Halletal.，2009)。2-Cys Prx以同源二聚體形式存在，在發(fā)揮抗氧化作用時，一條肽鏈上的Cys51巰基與另一肽鏈上的Cys172巰基之間脫氫形成分子間二硫鍵，即Cys51SSCys172，以供氫而還原氧化(Wooetal.，2003；章波等，2004)。同時，CaPrx基因序列存在2個特征肽段：“FYPLDFTFVCPTEI”和“FYPLDFT”，是典型2-Cys Prx的2個Cys的催化中心。另外，基于Prx的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹也反映出，本實(shí)驗克隆的CaPrx基因?qū)儆赑rx2類，是2-Cys Prx家族的一員。因此，推測CaPrx基因可能參與異育銀鯽體內(nèi)的抗氧化作用?，F(xiàn)已證實(shí)，除了Prx4基因，Prx基因家族的其他5種均沒有信號肽(章波等，2004)。CaPrx基因翻譯的蛋白預(yù)測無信號肽，說明它并不是一種分泌蛋白，因為信號肽可引導(dǎo)新合成的蛋白向分泌通路轉(zhuǎn)移，而CaPrx基因可能只是由游離的核糖體合成，主要定位于胞漿或核內(nèi)(Von，1990)。這與斑馬魚Prx2基因的研究結(jié)果一致(孫晶，薛壯，2015)。

圖6CaPrx基因在各組織中的表達(dá)情況
Fig. 6 The expression ofCaPrxmRNA in different tissues

HK. 頭腎head kidney， G. 鰓gill， E. 表皮epidermis， MK. 中腎middle kidney， B. 腦brain， H. 心臟heart， S. 脾臟spleen， M. 肌肉muscle，I. 腸道intestines， He. 血細(xì)胞hemocyte， L. 肝臟liver

圖7 健康異育銀鯽和感染CyHV-2病魚的Prx基因的差異表達(dá)Fig. 7 The significance expression of CaPrx mRNA between healthy and diseased Carassius auratus gibelio

柱狀圖上方不同字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，n=3)， 肝臟組用abc表示， 脾臟組用ABC表示

Significant differences (P<0.05，n=3) are shown in different letters above the histogram， with the liver group indicated by abc and the spleen group indicated by ABC

3.2 CaPrx的組織表達(dá)分析

根據(jù)實(shí)時熒光定量PCR的結(jié)果，CaPrx基因在肝臟、血細(xì)胞、腸道、鰓和肌肉等組織中均有表達(dá)，說明CaPrx基因可能參與了異育銀鯽體內(nèi)的多項生理活動，這個結(jié)果與日本囊對蝦Marsupenaeusjaponicus的研究結(jié)果相近(Maningasetal.，2008)。鑒于CaPrx基因的結(jié)構(gòu)，推測其參與了清除自由基ROS、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡等，具有廣泛的抗氧化作用。研究結(jié)果顯示，CaPrx基因在血液、肝臟和腸道中的表達(dá)量較高。血液是運(yùn)輸氧的組織，也是新陳代謝的重要場所；同時，血細(xì)胞中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等都參與了魚體的免疫防御。因此，CaPrx基因在血液中的高表達(dá)一方面說明了魚體的生理代謝需要有足夠的Prx來清除ROS，另一方面揭示了CaPrx基因與異育銀鯽的免疫功能有關(guān)。已有研究報道，動物肝中的線粒體是產(chǎn)生ROS的主要場所(Tayloretal.，1995)，大量ROS能夠?qū)е氯毡菊游rMacrobrachiumnipponense肝胰腺中Prx基因表達(dá)量顯著升高(孫盛明等，2014)。異育銀鯽肝臟Prx基因的高表達(dá)在一定程度上也說明了肝臟是異育銀鯽重要的抗氧化器官。此外，CaPrx基因在腸道中的表達(dá)也相對較高。由于腸道是能量與代謝十分旺盛的系統(tǒng)(陳群，2007)，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收過程中起重要作用，同時，腸道時刻面臨由食物氧化、重金屬、細(xì)菌代謝等產(chǎn)生的高含量ROS而帶來的危害，腸黏膜產(chǎn)生Prx有利于對抗ROS對機(jī)體的傷害(Dongetal.，2007)。組織表達(dá)顯示，CaPrx基因在異育銀鯽心臟中的表達(dá)量并不高。Schr?der等(2008)認(rèn)為Prx基因在心臟中的表達(dá)量較高，是心臟面對氧化應(yīng)激的重要因子。同時，Kumar等(2009)發(fā)現(xiàn)，在面對外界刺激如缺血和再灌注時，存在于線粒體中的Prx3會快速氧化成二硫化二聚體，含量發(fā)生顯著變化，而存在于胞質(zhì)中的Prx1和Prx2則沒有變化，因此，心臟中的Prx3被認(rèn)為是維持心臟功能的主要貢獻(xiàn)者。

3.3 CaPrx與免疫應(yīng)答

陳靜， 李婧慧， 劉訓(xùn)猛， 等. 2014. 江蘇鯽魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與產(chǎn)業(yè)亟待解決問題[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚， 12： 1-2.

陳群. 2007. 氧化應(yīng)激對動物消化道結(jié)構(gòu)與功能影響的研究[D]. 江蘇無錫： 江南大學(xué)： 83-87.

林秀秀， 葉元土， 吳萍， 等. 2016. 鯉皰疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)感染對異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)組織器官的損傷作用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 35(3)： 587-594.

劉文枝， 曾令兵， 張輝， 等. 2013. 異育銀鯽感染鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)后血液生理生化指標(biāo)變化的研究[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報， 22(6)： 928-935.

潘庭雙， 胡賢江， 蔣業(yè)林. 2001. 異育銀鯽的人工繁殖及苗種培育技術(shù)[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化， 4： 10-11.

孫晶， 薛壯. 2015. 斑馬魚過氧化物還原酶的生物信息學(xué)分析[J]. 生物技術(shù)， 25(1)： 36-41.

孫盛明， 戈賢平， 傅洪拓， 等. 2014. 日本沼蝦過氧化物還原酶基因的克隆及其表達(dá)分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 21(3)： 474-483.

王俊相， 李玉萍， 孔令富， 等. 2010. 魚類免疫系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 四川畜牧獸醫(yī)， 7： 29-31.

徐文斌， 孫曉波. 1993. 異育銀鯽的生物學(xué)特性及其在我省的增養(yǎng)殖前景[J]. 黑龍江水產(chǎn)， 2： 38-39.

袁軍法， 李莉娟， 黃建. 2013. Ⅱ型鯉皰疹病毒感染異育銀鯽對魚體血液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響[C]. ?？冢?中國水產(chǎn)學(xué)會魚病專業(yè)委員會2013年學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編.

張晗. 2014. 蘇北： 異育銀鯽鰓出血病爆發(fā)[J]. 海洋與漁業(yè)， 8(8)： 28-29.

章波， 向渝梅， 白云. 2004. 抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展， 35(4)： 352-355.

Dierick JF， Wenders F， Chainiaux F，etal. 2003. Retrovirally mediated overexpression of peroxiredoxin Ⅵ increases the survival of WI-38 human diploid fibroblasts exposed to cytotoxic doses of tert-butylhydroperoxide and UVB[J]. Biogerontology， 4： 125-131.

Dong WR， Xiang LX， Shao JZ. 2007. Cloning and characterisation of two natural killer enhancing factor genes (NKEF-A and NKEF-B) in pufferfish，Tetraodonnigroviridis[J]. Fish & Shellfish Immunology， 22： 1-15.

Fatma N， Singh DP， Shinohara T，etal. 2001. Transcriptional regulation of the antioxidant protein 2 gene， a thiol-specific antioxidant， by lens epithelium-derived growth factor to protect cells from oxidative stress[J]. Journal of Biological Chemistry， 276(52)： 48899-48907.

Fujii J， Ikeda Y. 2002. Advances in our understanding of peroxiredoxin， amultifunctional， mammalian redox protein[J]. Redox Report Communications in Free Radical Research， 7(3)： 123-130.

Hall A， Karplus A， Pool LB. 2009. Typical 2-Cys peroxiredoxins： structure， mechanisms and functions[J]. The FEBS Journal， 276(9)： 2469-2477.

Hofman B， Hecht HJ， Flohé L. 2002. Peroxiredoxins[J]. Biological Chemistry， 383： 347-364.

Kang SW， Rhee SG， Chang TS，etal. 2005. 2-Cys peroxiredoxin function in intracellular signal transduction： therapeutic implications[J]. Trends in Molecular Medicine， 11(12)： 571-578.

Kumar V， Kitaeff N， Hampton MB，etal. 2009. Reversible oxidation of mitochondrial peroxiredoxin 3 in mouse heart subjected to ischemia and reperfusion[J]. FEBS Letters， 583(6)： 997-1000.

Lee TH， Kim SU， Yu SL，etal. 2003. Peroxiredoxin Ⅱ is essential for sustaining life span of erythrocytes in mice[J]. Blood， 101： 5033-5038.

Livak KJ， Schmittgen TD. 2001.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (delta delta C(T)) method[J]. Methods， 25： 402-408.

Maningas MBB， Koyama T， Kondo H，etal. 2008. A peroxiredoxin from kuruma shrimp，Marsupenaeusjaponicus， inhibited by peptidoglycan[J]. Developmental & Comparative Immunology， 32： 198-203.

Mu CK， Zhao JM， Wang LL，etal. 2009. Molecular cloning and characterization of peroxiredoxin 6 from Chinese mitten crabEriocheirsinensis[J]. Fish & Shellfish Immunology， 26： 821-827.

Nonn L， Berggren M， Powis G. 2003. Increased expression of mitochondrial peroxiredoxin-3 (thioredoxin peroxidase-2) protects cancer cells against hypoxia and drug-induced hydrogen peroxide-dependent apoptosis[J]. Molecular Cancer Research， 1(9)： 682-689.

Nordberg J， Arnér ES. 2001. Reactive oxygen species， antioxidants， and the mammalian thioredoxin system[J]. Free Radical Biology & Medicine， 31(11)： 1287-1312.

Ren L， Xu T， Wang R，etal. 2013. Miiuy croaker (Miichthysmiiuy) Peroxiredoxin 2： molecular characterization， genomic structure and immune response against bacterial infection[J]. Fish & Shellfish Immunology， 34(2)： 556-563.

Schr?der E， Brennan JP， Eaton P，etal. 2008. Cardiac peroxiredoxins undergo complex modifications during cardiac oxidant stress[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology， 295： H425-H433.

Singh AK， Shichi H. 1998. A novel glutathione peroxidase in bovine eye. Sequence analysis， mRNA level， and translation[J]. Journal of Biological Chemistry， 273(40)： 26171-26178.

Taylor DE， Ghio AJ， Piantadosi CA. 1995. Reactive oxygen species produced by liver mitochondria of rats in sepsis[J]. Archives of Biochemistry & Biophysics， 316(1)： 70-76.

Von HG. 1990. The signal peptide [J]. Journal of Membrane Biology， 115(3)： 195-201.

Woo HA， Chae HZ， Hwang SC，etal. 2003. Reversing the inactivation of peroxiredoxins caused by cysteine sulfinic acid formation[J]. Science， 300(5619)： 653-656.

Wu C， Cao J， Cao F，etal. 2016. Molecular cloning， characterization and mRNA expression of six peroxiredoxins from black carpMylopharyngodonpiceusin response to lipopolysaccharide challenge or dietary carbohydrate[J]. Fish & Shellfish Immunology， 50： 210-222.

Yeh HY， Klesius PH. 2007. cDNA cloning， characterization， and expression analysis of channel catfish (IctaluruspunctatusRafinesque， 1818) peroxiredoxin 6 gene[J]. Fish Physiology & Biochemistry， 33(3)： 233-239.