王 琳,高辰哲,劉丹怡,劉 琳,李明洋,李海龍,韓建春,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江 哈爾濱 150000)

紅豆是一種藥食同源的食物,味甘、無(wú)毒,在日常生活中較為常見(jiàn)[1-2],其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和顯著的抗氧化作用,種皮中含有多酚、單寧、皂苷等多種生物活性物質(zhì)[3-4],以紅豆為原料制作的食品深受大眾喜愛(ài)。在飲料行業(yè)中,紅豆可做成多種飲料[5-8],如紅豆乳飲料[9]、紅豆纖維飲料[10]等。紅豆發(fā)酵食品也廣受喜愛(ài),如紅豆果醋[11]、紅豆果酒[12]、紅豆米酒[13]等。

納豆是一種大豆發(fā)酵食品,含有卵磷脂、維生素E、多胺等成分[14]?，F(xiàn)有研究表明,納豆具有降血壓、溶血栓、抗菌、抗腫瘤、預(yù)防骨質(zhì)疏松等功能[15]。雖然納豆是一種成本低廉、營(yíng)養(yǎng)豐富的功能性食品,但因其具有的特殊氨臭味不易被廣大消費(fèi)者接受[16-17]。而紅豆具有較高的水分、粘多糖及總氨基酸含量,可以作為納豆制作原料[18]。

接種量、接種種齡對(duì)納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)的生長(zhǎng)狀態(tài)具有重要影響[19]。本研究以紅豆為原料,選取優(yōu)選高產(chǎn)納豆菌株,采用單因素法探索接種量、接種種齡及發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆納豆品質(zhì)的影響,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了紅豆納豆發(fā)酵工藝,旨在創(chuàng)新紅豆納豆發(fā)酵工藝,開(kāi)發(fā)新型納豆產(chǎn)品,以期為紅豆相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆:黑龍江齊齊哈爾綠谷米業(yè)；納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilisnatto)1.1086:中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究所；纖維蛋白原(凝固物含量為59%)、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(1 240 IU/支):中國(guó)藥品生物制品檢定所；葡萄糖(分析純):中國(guó)浙江玉環(huán)紅星生化制品廠。

固體斜面培養(yǎng)基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,瓊脂1.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

液體培養(yǎng)基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

二級(jí)培養(yǎng)基:蛋白胨1%,牛肉膏0.5%,氯化鈉0.5%,葡萄糖1%,pH 7.2～7.4,121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BL610電子天平:上海靜天電子儀器有限公司；DK-98-I電子恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市江南儀器廠；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠制造；303A型電熱恒溫培養(yǎng)箱:瀘南電爐烘箱廠；LDZX-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 紅豆納豆制作工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn):將納豆芽孢桿菌接種到固體斜面培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)12 h使其活化后,用接菌環(huán)挑兩環(huán)納豆芽孢桿菌接種到裝有液體培養(yǎng)基的試管中37℃培養(yǎng)8 h,之后接種到二級(jí)培養(yǎng)基,200 r/min的搖床18℃恒溫培養(yǎng)24 h,備用。

選取顆粒飽滿的優(yōu)質(zhì)市售紅豆作為原料,清水沖洗2～3遍去除雜質(zhì),用3倍質(zhì)量的清水浸泡,以吸水后質(zhì)量增加2倍為宜。在相同規(guī)格的紗布袋中裝入洗凈后瀝干水的濕豆子,每個(gè)袋子裝500 g,121℃滅菌30 min,重復(fù)滅菌兩次,第二次滅菌時(shí),將首尾兩端袋子對(duì)調(diào),保證充分滅菌及蒸煮。于無(wú)菌操作臺(tái)中冷卻至45℃后,將一定量菌液接入到處理過(guò)的紅豆中,攪拌均勻,使菌液充分與紅豆接觸,于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間。將發(fā)酵好的成品放入4℃的冰箱中,后熟24 h,得成品。

1.3.2 紅豆納豆發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

選擇接種量、接種種齡、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn),考察接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、接種種齡(9 h、12 h、15 h、18 h、21 h)、發(fā)酵時(shí)間(16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h)對(duì)紅豆納豆中納豆激酶酶活力和紅豆納豆感官品質(zhì)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化紅豆納豆發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取接種量(A)、接種種齡(B)和發(fā)酵時(shí)間(C)3個(gè)因素為自變量,以感官評(píng)分(R)為響應(yīng)值,設(shè)置3因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)紅豆納豆發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 紅豆納豆發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of red bean natto

1.3.4 檢測(cè)方法

納豆激酶酶活力的測(cè)定[20-21]:取適量尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品,用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100 IU/mL、150 IU/mL、200 IU/mL、250 IU/mL、300 IU/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,用微量進(jìn)樣器注入平板孔內(nèi),測(cè)定溶圈直徑,計(jì)算溶圈面積,以尿激酶酶活力(x)為橫坐標(biāo),溶圈面積(y)為縱坐標(biāo),繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取新鮮紅豆納豆1 g加入20 mL無(wú)菌去離子水中,充分振蕩后進(jìn)行過(guò)濾,取10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板,10 min后37℃保溫18 h,測(cè)定溶圈直徑,計(jì)算溶圈面積,由尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測(cè)樣品中納豆激酶酶活力。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

在本學(xué)院選擇20名學(xué)生(10男10女)組成感官評(píng)價(jià)小組,采用雙盲法從顏色、香氣、滋味、組織形態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行打分。隨機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)字編碼,排列樣品順序,滿分100分,感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 紅豆納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of red bean natto

2 結(jié)果與分析

2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以尿激酶酶活力(x)為橫坐標(biāo),溶圈面積(y)為縱坐標(biāo),繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of urokinase

由圖1可知,尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.005 2x+0.879 6,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1,表明尿激酶酶活與溶圈面積線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 接種量對(duì)紅豆納豆發(fā)酵的影響研究

考察接種量對(duì)紅豆納豆中納豆激酶酶活與感官品質(zhì)的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)納豆激酶酶活力與感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of inoculum on nattokinase activity and sensory quality

由圖2可知,隨著接種量的增加,納豆激酶酶活力和感官評(píng)分均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為6%時(shí),產(chǎn)品中納豆激酶酶活力達(dá)到最大值,為1 148 U/g,感官評(píng)分為93分；當(dāng)接種量為8%時(shí),酶活力為1 112 U/g,感官評(píng)分為94分。接種量在2%～8%范圍內(nèi),感官綜合評(píng)分呈上升趨勢(shì)；當(dāng)接種量＞8%,感官評(píng)分開(kāi)始下降。這可能因?yàn)楫?dāng)接種量過(guò)小時(shí),菌體則無(wú)法在發(fā)酵液內(nèi)充分生長(zhǎng),接種量達(dá)到6%時(shí),發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分被充分利用,納豆激酶活力達(dá)到最大；當(dāng)接種量＞6%時(shí),紅豆基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以維持芽孢桿菌快速增殖,從而抑制了相對(duì)酶活力[22-23]。此階段感官評(píng)分呈現(xiàn)上升趨勢(shì),說(shuō)明增加納豆激酶接種量有助于紅豆納豆品質(zhì)的提升,接種量＞8%時(shí)感官評(píng)分開(kāi)始下降,可能是因?yàn)檫^(guò)多的納豆激酶阻礙了體系的氧氣傳遞和菌體獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),影響了紅豆納豆的品質(zhì)。綜合比較,選擇接種量6%作為最適接種量。

2.2.2 接種種齡對(duì)納豆激酶酶活的影響

考察接種量對(duì)紅豆納豆中納豆激酶酶活與感官品質(zhì)的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 接種種齡對(duì)納豆激酶酶活力與感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of inoculation age on nattokinase activity and sensory quality

納豆芽孢桿菌培養(yǎng)10～15 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌體生長(zhǎng)旺盛,有利于縮短微生物生長(zhǎng)動(dòng)力曲線中延遲期的時(shí)間。由圖3可知,隨著接種菌齡的增長(zhǎng),納豆激酶酶活力整體呈先增加后下降的趨勢(shì),而感官評(píng)分先增加后趨于平穩(wěn),當(dāng)接種種齡為15 h時(shí),納豆激酶酶活力達(dá)到最高值,為1 147 U/g；當(dāng)接種種齡為18 h時(shí),感官評(píng)分達(dá)到最高,為94分。這可能是因?yàn)榻尤氚l(fā)酵液內(nèi)的菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,即菌體處于旺盛生長(zhǎng)階段,短時(shí)間內(nèi)會(huì)生成大量的納豆激酶,具備較高的酶活力。當(dāng)接種種齡為18 h時(shí),菌體結(jié)束對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,此時(shí)菌體的細(xì)胞含量最高,納豆激酶酶活力開(kāi)始下降,但發(fā)酵速度依然較高,感官品質(zhì)最佳。綜合比較,因此選取接種種齡為18 h的納豆芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆納豆發(fā)酵的影響

考察接種量對(duì)紅豆納豆中納豆激酶酶活與感官品質(zhì)的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶酶活力與感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on nattokinase activity and sensory quality

由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),納豆激酶酶活力和感官評(píng)分整體均呈先增加后下降的趨勢(shì),當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為22h時(shí),產(chǎn)品紅豆納豆的納豆激酶酶活力和感官評(píng)分均達(dá)到最大值,分別為1 058 U/g和94分。原因可能是在較短的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),微生物不能完全利用紅豆的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行增殖生長(zhǎng),而過(guò)長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間會(huì)造成紅豆基質(zhì)中剩余的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以維持納豆芽孢桿菌快速增殖及大量納豆激酶合成,從而導(dǎo)致納豆激酶酶活力降低。因此,確定最適發(fā)酵時(shí)間為22 h。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化紅豆納豆發(fā)酵工藝

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明接種量、接種種齡與發(fā)酵時(shí)間均對(duì)納豆激酶酶活力及紅豆納豆感官評(píng)分具有影響作用,與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[24-25]。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取接種量(A)、接種種齡(B)和發(fā)酵時(shí)間(C)為影響因素,以感官評(píng)分(R)為響應(yīng)值,根據(jù)響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平的二次回歸方程來(lái)擬合因素和指標(biāo)(響應(yīng)值)之間的函數(shù)關(guān)系,確定最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 紅豆納豆發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of red bean natto

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得二次多項(xiàng)回歸模型方程為:

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

由表3可知,方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯,該模型極顯著(P＜0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05),并且該模型R2=98.99%,R2adj=97.70%,說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好,自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著,可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)。由F值大小可以推斷影響紅豆納豆感官品質(zhì)的各因素主次順序?yàn)?C＞A＞B,即發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞接種種齡。一次項(xiàng)A和交互項(xiàng)AB、BC對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分的影響顯著(P＜0.05)；一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)A2、C2對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分的影響極顯著(P＜0.01)。其他因素對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分的影響不顯著(P＞0.05)。

利用Design Expert 8.0.6軟件,作出各因素對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分的響應(yīng)面分析圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀,分析接種量、接種種齡、發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 接種量、接種種齡和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between inoculum,inoculation age and fermentation time on sensory evaluation of red bean natto

由圖5可知,接種量與發(fā)酵時(shí)間、接種量與接種種齡、接種種齡與發(fā)酵時(shí)間之間均有一定的交互作用,最佳預(yù)測(cè)點(diǎn)在試驗(yàn)考察范圍內(nèi)。因此,該二階模型具有良好的擬合度,能真實(shí)地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。接種量、接種種齡、發(fā)酵時(shí)間與紅豆納豆感官評(píng)分有顯著的相關(guān)性,表現(xiàn)為曲面較陡,其中發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅豆納豆感官評(píng)分影響最大。結(jié)合等高線的疏密程度可知,接種量與接種時(shí)間的交互作用影響更顯著,接種量與接種種齡、接種種齡與發(fā)酵時(shí)間兩兩之間有一定的交互作用,但交互作用的影響不如接種量與接種時(shí)間的交互作用影響顯著。

為獲取最大感官綜合值,采用聯(lián)合求解法確定最佳發(fā)酵工藝條件為:接種量6.03%、接種種齡18.00 h、發(fā)酵時(shí)間21.58 h。為符合實(shí)際生產(chǎn)需求,將最佳發(fā)酵工藝條件修正為接種量6%、接種種齡18 h、發(fā)酵時(shí)間21.5 h,在此發(fā)酵工藝條件下,理論預(yù)測(cè)感官評(píng)分為97分。

為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可信度,采用同樣工藝條件進(jìn)行3次紅豆納豆的平行發(fā)酵試驗(yàn),得到紅豆納豆感官評(píng)分的平均值為97.7分,與理論預(yù)測(cè)值差異不明顯,測(cè)定納豆激酶酶活力平均值為1 140 U/g。表明該模型準(zhǔn)確可靠,利用該模型在紅豆納豆生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn),利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紅豆納豆發(fā)酵工藝條件,最終得到優(yōu)化發(fā)酵工藝條件為:接種量6%、接種種齡18 h、發(fā)酵時(shí)間21.5 h,在此工藝條件下,發(fā)酵得到的紅豆納豆具有納豆的香味,滋味獨(dú)特,色澤誘人,黏液量豐富,感官評(píng)分為97.7分,納豆激酶酶活力為1140U/g,與響應(yīng)面法預(yù)測(cè)值差異不明顯,驗(yàn)證了試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目尚行?為紅豆產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及紅豆納豆的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

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