鄒甜　孫波　王志偉　龔思　陳澤南　孫小武

摘要：離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體是植物單倍體育種的重要手段之一，筆者對(duì)葫蘆科植物離體雌核發(fā)育影響因素的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，主要包括基因型、取樣時(shí)期和取樣部位、培養(yǎng)基、預(yù)處理、栽培季節(jié)等對(duì)葫蘆科蔬菜離體雌核發(fā)育的影響，并對(duì)離體雌核發(fā)育存在的問(wèn)題進(jìn)行了分析和討論，以期為葫蘆科蔬菜離體雌核發(fā)育研究工作的開(kāi)展提供參考。

關(guān)鍵詞：葫蘆科；離體雌核發(fā)育；單倍體育種；未受精胚珠；未授粉子房

離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體是指在離體條件下未受精胚囊細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株的過(guò)程，有未授粉子房培養(yǎng)和未受精胚珠培養(yǎng)2種途徑，是單倍體育種的重要手段之一。1979年San Noeumm首次通過(guò)大麥未受精子房培養(yǎng)獲得了單倍體植株，并第一次提出以“雌核發(fā)育”來(lái)定義這一過(guò)程。通過(guò)離體雌核發(fā)育可以迅速得到單倍體及雙單倍體植株，與常規(guī)育種相比，離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體技術(shù)大大加快了育種進(jìn)程，提高了育種效率，豐富了種質(zhì)資源。目前，利用此技術(shù)已經(jīng)成功地從多種植物中獲得了單倍體植株，被廣泛應(yīng)用于育種實(shí)踐和遺傳研究。葫蘆科離體雌核發(fā)育研究工作從20世紀(jì)90年代開(kāi)始進(jìn)行，并成功在西葫蘆、甜瓜、黃瓜上獲得了單倍體或雙單倍體植株。近幾年來(lái)，離體雌核發(fā)育在葫蘆科蔬菜上更是發(fā)展迅速，閔子揚(yáng)等于2016年首次在南瓜上獲得單倍體植株，而離體雌核發(fā)育技術(shù)進(jìn)一步成為黃瓜單倍體育種最常用的育種手段，已陸續(xù)育成新品種‘津美3號(hào)、‘津優(yōu)401和‘津優(yōu)409。另外，離體雌核發(fā)育還被應(yīng)用于分子遺傳圖譜的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因育種研究。眾多研究表明，離體雌核發(fā)育研究工作的開(kāi)展對(duì)葫蘆科蔬菜育種和遺傳研究具有重大意義，但是此項(xiàng)研究還處于初級(jí)階段，還存在出胚率低、胚質(zhì)量差等諸多問(wèn)題?；诖?，筆者對(duì)影響葫蘆科蔬菜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)的影響因素進(jìn)行分析和總結(jié)，以期為葫蘆科蔬菜離體雌核發(fā)育研究工作的開(kāi)展提供參考。

1影響離體雌核發(fā)育的主要因素

1.1基因型

大量研究表明離體雌核發(fā)育和離體雄核發(fā)育一樣具有明顯的基因依賴性，供體植株的基因型不僅影響出胚率，還影響胚的質(zhì)量。在同等誘導(dǎo)條件下，不同基因型材料其誘導(dǎo)率和出胚率有極顯著差異，特定的基因型只對(duì)特定的培養(yǎng)基有反應(yīng)。榮文娟等以8個(gè)不同基因型西瓜品種為材料進(jìn)行未受精胚珠培養(yǎng)，其胚珠啟動(dòng)率差異較大，從57.2%到92.3%不等。劉立功等進(jìn)行黃瓜離體雌核發(fā)育研究，發(fā)現(xiàn)7個(gè)品種都能誘導(dǎo)出胚狀體，但其出胚率最高可達(dá)25.3%，最低只有0.7%。閔子揚(yáng)等對(duì)6個(gè)南瓜品種進(jìn)行了未受精子房離體培養(yǎng)，其中5個(gè)品種可以誘導(dǎo)出胚狀體，但出胚率有較大差異，另外1個(gè)品種不能誘導(dǎo)出胚。

1.2取樣時(shí)期和取樣部位

取樣時(shí)期關(guān)系到胚珠中胚囊細(xì)胞的發(fā)育程度，而胚囊發(fā)育時(shí)期對(duì)離體雌核發(fā)育胚狀體的誘導(dǎo)有著極其重要的影響。不同種類(lèi)作物適合進(jìn)行離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)的取樣時(shí)期不盡相同，在葫蘆科作物中以接近成熟或成熟的胚囊細(xì)胞效果最好。謝冰等認(rèn)為開(kāi)花當(dāng)天的西葫蘆未受精胚珠的活力較高最有利于離體雌核發(fā)育。孫守如等、陳玲、閔子揚(yáng)等均認(rèn)為開(kāi)花當(dāng)天南瓜雌花進(jìn)行離體雌核誘導(dǎo)其出胚率最高，且孫守如等認(rèn)為開(kāi)花當(dāng)天的外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織少且不易褐化。另外，Li等以甜瓜為研究材料得到了相同結(jié)果。Gemes-Juhfisz等研究黃瓜離體雌核發(fā)育則發(fā)現(xiàn)雌花開(kāi)放前6h的胚囊剛好成熟，此時(shí)胚的誘導(dǎo)率最高，而杜勝利、Diao等則認(rèn)為開(kāi)花前2～3d的黃瓜未受精子房的胚誘導(dǎo)率最高。

此外，子房的發(fā)育情況也影響雌核發(fā)育的誘導(dǎo)。趙曉菲和劉立功等研究了取樣部位對(duì)離體雌核發(fā)育的影響，結(jié)果表明，采收于相對(duì)中間的節(jié)位的未受精子房有利于誘導(dǎo)雌核發(fā)育，子房采收部位過(guò)高或過(guò)低都不利于胚狀體誘導(dǎo)。在黃瓜未授粉子房培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，取自第21～第30節(jié)位的子房誘導(dǎo)時(shí)出胚率最高，節(jié)位往上出胚率降低。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1基本培養(yǎng) 基基本培養(yǎng)基對(duì)離體雌核發(fā)育胚狀體誘導(dǎo)率有一定的影響，從研究報(bào)道來(lái)看，葫蘆科作物大部分使用MS作為基本培養(yǎng)基進(jìn)行離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)。謝冰以西葫蘆為試材研究了MS、N6、B5、Miller 4種培養(yǎng)基對(duì)離體雌核發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)MS和N6培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果較好。程慧等同樣以西葫蘆未受精子房為材料比較MS、B5、N6和White 4種培養(yǎng)基并得到了相同的結(jié)果，其研究表明MS基本培養(yǎng)基更有利于誘導(dǎo)胚狀體，胚狀體誘導(dǎo)率達(dá)16.67%，N6培養(yǎng)基次之，胚狀體誘導(dǎo)率為13.33%。在黃瓜未受精子房培養(yǎng)中也有使用CBM培養(yǎng)基和改良培養(yǎng)基。

1.3.2外源激素 前人研究表明，培養(yǎng)基中外源激素的種類(lèi)和濃度配比對(duì)雌核發(fā)育的誘導(dǎo)有著極其重要的影響，但是不同作物甚至不同品種所適用的激素種類(lèi)和濃度不同。在葫蘆科離體雌核發(fā)育研究中2，4-D、NAA、6-BA、TDZ等被廣泛應(yīng)用。以西葫蘆為試材，趙曉菲研究發(fā)現(xiàn)MS+0.1mg·L^-1NAA+2.0mg·L^-16-BA培養(yǎng)基能有效誘導(dǎo)不定芽，而葛志東的試驗(yàn)中以3.0mg·L^-12，4-D+0.25mg·L^-1NAA+1.0mg·L^-16-BA效果最好。以南瓜為試材，孫守如等認(rèn)為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L^-12，4-D+0.25mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-16-BA，其出胚率高達(dá)31.1%，而閔子揚(yáng)等則認(rèn)為添加0.06mg·L^-1TDZ時(shí)誘導(dǎo)可直接出胚，操作上更簡(jiǎn)潔方便。以黃瓜為試材，裴曉利、LI等、E.Moqbeli等研究了TDZ對(duì)離體雌核發(fā)育的影響，并一致認(rèn)為T(mén)DZ有利于胚狀體的誘導(dǎo)。裴曉利的試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加0.06mg·L^-1或0.08mg·L^-1TDZ有利于黃瓜胚狀體誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高達(dá)92.00%和93.10%。E.Moqbeli等則認(rèn)為添加0.04mg·L^-1TDZ效果較好。LI等認(rèn)為添加0.03～0.07mg·L^-1的TDZ均有利于黃瓜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)，但是不同品種的最適TDZ濃度不一樣。另外，TDZ也有利于甜瓜和西瓜離體雌核發(fā)育。榮文娟等曾報(bào)道TDZ較2，4-D和KT更有利于促進(jìn)西瓜雌核發(fā)育，在培養(yǎng)基中添加0.05mg·L^-1TDZ+2.0mg·L^-16-BA+3mg·L^-1NAA時(shí)愈傷誘導(dǎo)率最高。另外，TDZ和NAA結(jié)合使用有利于胚狀體誘導(dǎo)和生根成苗，以0.05mg·L^-1TDZ+0.25mg·L^-1NAA效果最好。endprint

除此之外，IAA、IBA和NAA等激素多被用于再生植株的生根培養(yǎng)，KoLI等在進(jìn)行甜瓜未受精胚珠培養(yǎng)時(shí)對(duì)IAA、IBA、NAA3種激素對(duì)再生植株生根的影響進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下IAA比IBA和NAA更有利于再生植株生根。近年來(lái)，GA也被用于離體雌核發(fā)育研究，有報(bào)道在再生培養(yǎng)基中添加0.4-0.8mg·L^-1的GA時(shí)可有效打破再生植株“花打頂”現(xiàn)象從而提高植株再生率，且GA有利于再生植株生根，使根系粗且長(zhǎng)。

1.3.3蔗糖 陳學(xué)軍等認(rèn)為碳源影響著培養(yǎng)基的滲透壓，而雌核發(fā)育需要在較低的滲透壓中進(jìn)行。在前人研究中，葫蘆科離體雌核發(fā)育的培養(yǎng)基中多添加30g·L^-1蔗糖。謝冰等、Shalaby等都曾研究蔗糖濃度對(duì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)的影響，謝冰等人的研究表明，在MS培養(yǎng)基中分別添加10、20、30、40g·L^-1蔗糖時(shí)，添加30g·L^-1蔗糖的培養(yǎng)基出胚最多，Shalaby等人則是在培養(yǎng)基中分別添加了30、60、90g·L^-1蔗糖，發(fā)現(xiàn)添加30g·L^-1蔗糖時(shí)胚珠啟動(dòng)率最高，90g·L^-1時(shí)胚珠幾乎不發(fā)育。另外，蔗糖濃度對(duì)胚狀體成苗有一定影響，在培養(yǎng)基中添加20g·L^-1蔗糖時(shí)胚狀體成苗率最高，西葫蘆再生植株生長(zhǎng)健壯，較易馴化、移栽。

1.3.4附加成分 通常培養(yǎng)基中也會(huì)添加少量附加成分，如抗壞血酸（Vc）、活性炭（AC）、硝酸銀（AgNO₃）、各種氨基酸等等。Vc、AC、和AgNO₃都是常見(jiàn)的抗氧化劑和吸附劑，可以有效減輕外植體的褐化，有利于離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)和植株的再生。另外，陳學(xué)軍等認(rèn)為高濃度的NO_3-有利于不定芽的產(chǎn)生，刁衛(wèi)平等、裴曉利、LI等的試驗(yàn)均證明硝酸銀有利于黃瓜離體雌核發(fā)育。并且，刁衛(wèi)平等人認(rèn)為，硝酸銀可以提高胚發(fā)生率，同時(shí)能縮短胚出現(xiàn)的時(shí)間并提高胚的產(chǎn)量，最佳添加量為20mg·L^-1。

1.4預(yù)處理

預(yù)處理方式對(duì)離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)有著極其重要的影響。預(yù)處理主要有黑暗熱激和低溫處理2種途徑。一般認(rèn)為預(yù)處理改變了細(xì)胞的生理狀態(tài)，影響其分裂方式和分化方向，但是不同基因型對(duì)溫度的敏感度不同，因此最佳處理溫度和時(shí)間也不一樣。多項(xiàng)研究表明適當(dāng)?shù)臒峒ぬ幚砜梢约ぐl(fā)雌核發(fā)育的啟動(dòng)，縮短胚狀體的誘導(dǎo)時(shí)間。35℃熱激在試驗(yàn)中應(yīng)用較多，G6mes-Juhtlsz等、E.Moqbeli等、Pivada等的研究均表明，熱激有利于黃瓜離體雌核發(fā)育，并認(rèn)為在35℃條件下熱激2～4d時(shí)誘導(dǎo)率和植株再生率最高，孫守如等、陳玲㈣、葛志東則認(rèn)為熱激處理5d效果最好。然而，王璐等認(rèn)為25℃比35℃更適合黃瓜離體雌核發(fā)育的啟動(dòng)，這可能與供體材料基因型不同有關(guān)，牛明明也認(rèn)為30℃較35℃更有利于甜瓜雌核發(fā)育誘導(dǎo)。

低溫預(yù)處理的誘導(dǎo)效果隨外植體不同而不同，Metwally等認(rèn)為4℃低溫預(yù)培養(yǎng)不利于南瓜離體雌核誘導(dǎo)，但是有利于甜瓜離體雌核誘導(dǎo)。Malik等也認(rèn)為低溫預(yù)處理（4℃）4d可以有效提高甜瓜出胚率。而榮文娟等㈣的試驗(yàn)結(jié)果表明在進(jìn)行西瓜雌核誘導(dǎo)時(shí)4℃處理沒(méi)有明顯效果，且其對(duì)胚珠反應(yīng)率和愈傷誘導(dǎo)率的影響隨培養(yǎng)基成分不同而變化。

1.5栽培季節(jié)

栽培季節(jié)影響著離體雌核發(fā)育的誘導(dǎo)率和出胚率。陳學(xué)軍等、趙曉菲曾報(bào)道不同播期的西葫蘆雌核發(fā)育誘導(dǎo)率存在極顯著差異，以秋播的誘導(dǎo)率最高，夏季次之，春季栽培誘導(dǎo)率最低。陳學(xué)軍等人認(rèn)為，這可能與日照長(zhǎng)度有關(guān)，西葫蘆是短日照植物，秋播時(shí)短日照條件刺激了雌核發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。魏愛(ài)民等的研究也表明，溫度較高且陽(yáng)光充足時(shí)黃瓜未受精子房的出胚率和成苗率明顯高于其他季節(jié)，并且塑料大棚內(nèi)的供體植株比露地植株污染率低且更容易誘導(dǎo)單倍體。

1.6接種方式

子房或胚珠不同的消毒方式和切割方式對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)也有一定影響。陳玲、閔子揚(yáng)等有報(bào)道，先切片再消毒比先消毒再切片更有利于南瓜未受精子房進(jìn)行離體雌核誘導(dǎo)。陳學(xué)軍等和陳玲比較了橫切、縱切、切啄、完整胚珠4種方式對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率的影響，均認(rèn)為橫切最有利于離體雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率最高達(dá)28%。

2再生植株的馴化移栽

再生植株的苗齡、質(zhì)量、馴化方式、移栽時(shí)的溫度和基質(zhì)對(duì)再生植株的成活率都有不同程度的影響。謝冰等在研究的基礎(chǔ)上提出了“循序漸進(jìn)”原則，讓組培苗逐漸適應(yīng)出瓶后的環(huán)境，即在西葫蘆再生植株長(zhǎng)至7～8片葉時(shí)置于晝溫22～28℃、夜溫12～18℃條件下，進(jìn)行先閉瓶再開(kāi)瓶逐步馴化，當(dāng)移栽基質(zhì)為V_蛭石：V_草炭為1：1時(shí)成活率最高，可達(dá)95.0%以上。趙曉菲等在再生植株具有5～6片真葉時(shí)馴化移栽，成活率也高達(dá)90.0%。

3再生植株倍性鑒定

離體雌核培養(yǎng)的再生植株理論上起源于胚囊成員細(xì)胞，所以再生植株應(yīng)該是單倍體和自然加倍的雙單倍體，但也有可能是由珠心、珠被等體細(xì)胞發(fā)育而成的二倍體，因此再生植株倍性的鑒定是后續(xù)利用的基礎(chǔ)。植株鑒定的方法早有報(bào)道，主要有染色體計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞測(cè)定法、葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法、雜交鑒定法、同工酶鑒定法和形態(tài)學(xué)鑒定法等。杜勝利曾以黃瓜離體雌核培養(yǎng)的再生植株為材料研究和比較了幾種不同的倍性鑒定方法，發(fā)現(xiàn)最有效最直接的鑒定方法是體細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法，試驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。不同倍性植株的葉片保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體個(gè)數(shù)、染色體中心直徑和異染色體數(shù)目都不一樣，可以間接鑒定黃瓜再生植株的倍性。另外，也可以根據(jù)不同倍性植株的長(zhǎng)勢(shì)、花冠形態(tài)、花粉粒及結(jié)籽的差異來(lái)輔助判斷再生植株倍性。目前倍性鑒定應(yīng)用最多的是染色體計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，但是二倍體再生植株就必須應(yīng)用分子標(biāo)記等技術(shù)鑒定其純合性。不過(guò)我們也可以對(duì)再生植株自交后代進(jìn)行整齊度試驗(yàn)，這樣不僅可以確定再生植株純合性，同時(shí)還可以調(diào)查記錄其農(nóng)藝性狀。

4問(wèn)題與展望

利用離體雌核發(fā)育技術(shù)進(jìn)行單倍體育種已經(jīng)成功地在黃瓜上進(jìn)行了實(shí)踐，天津科潤(rùn)黃瓜研究所將離體雌核發(fā)育技術(shù)與常規(guī)育種結(jié)合，成功培育出了新一代長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、分支少、抗病性強(qiáng)、豐產(chǎn)性好的黃瓜品種，其利用單倍體技術(shù)創(chuàng)制黃瓜育種新材料研究達(dá)到了國(guó)際先進(jìn)水平。與離體雄核發(fā)育相比離體雌核發(fā)育具有許多優(yōu)勢(shì)，通過(guò)離體雌核發(fā)育產(chǎn)生的再生植株白化苗比例低，并且能夠從雄性不育植株或雌株中培育出單倍體植株。但是現(xiàn)今階段離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體技術(shù)還存在許多問(wèn)題，如出胚率低、重復(fù)性差、再生植株玻璃化嚴(yán)重、畸形率高、倍性鑒定難度高等。離體雌核發(fā)育基因依賴性很強(qiáng)，有些品種的出胚率很低，甚至無(wú)法誘導(dǎo)出胚。另外，離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)過(guò)程受其他如植株生長(zhǎng)環(huán)境、胚囊發(fā)育時(shí)期、激素水平等多種因素的影響，因此其重復(fù)性不高，很難進(jìn)行規(guī)?；N材料創(chuàng)制。此外，再生植株培養(yǎng)過(guò)程中玻璃化嚴(yán)重和畸形率高造成再生植株成活率低，是離體雌核發(fā)育應(yīng)用于育種實(shí)踐的又一大障礙。為提高試管苗成活率，胡芳芳等對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，并優(yōu)化了植株培養(yǎng)條件，降低了玻璃化程度，但是最高成活率也僅有46.67%。

雖然葫蘆科植物離體雌核發(fā)育技術(shù)已經(jīng)取得一些進(jìn)展，但單倍體誘導(dǎo)率和植株成活率仍然很低，仍然無(wú)法滿足育種實(shí)踐的需要，所以如何建立高效、穩(wěn)定的植株再生體系是我們亟待解決的問(wèn)題。另外，深入研究離體雌核發(fā)育機(jī)制也是提高單倍體育種技術(shù)效率的關(guān)鍵。通過(guò)離體雌核發(fā)育技術(shù)創(chuàng)制大量育種新材料，然后利用分子標(biāo)記輔助選擇可進(jìn)一步提高育種效率。所以，打破基因型依賴，建立高效、可重復(fù)的培養(yǎng)體系，探索更為簡(jiǎn)單、有效的倍性鑒定方法，與常規(guī)育種和分子標(biāo)記輔助育種緊密結(jié)合，對(duì)雌核發(fā)育進(jìn)行深層次研究是我們科研工作者的努力方向。endprint