王潤錦，陳 羲，馬金英

（1.西藏自治區(qū)山南市畜牧獸醫(yī)總站，西藏 山南 856100；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常被稱為大腸桿菌，是人和動物腸道共生菌，可以作為社區(qū)和農(nóng)場中各種細(xì)菌耐藥性發(fā)生情況的指標(biāo)菌，而藏豬主要分布于雅魯藏布江流域中游河谷區(qū)和藏東三江流域中游海拔為3 500 m左右的氣候條件惡劣的高原地帶，是我國唯一的高原豬種[1-2]。藏豬具有肉質(zhì)優(yōu)良、耐嚴(yán)寒、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但隨著川藏公路拉薩-林芝沿線藏豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，藏豬養(yǎng)殖初具規(guī)模化，一些傳染性疾病也日漸嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成不小經(jīng)濟(jì)損失。對藏豬源大腸桿菌和腸球菌開展耐藥性調(diào)查及其耐藥機(jī)制研究，在獸醫(yī)及人醫(yī)領(lǐng)域均有重要的公共衛(wèi)生意義[3]。筆者于2016年8月對拉薩-林芝公路沿線12個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬采集直腸棉拭子共計(jì)1 200份，分離出了大腸桿菌，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步做了菌株分離及耐藥性的檢測，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)為采樣點(diǎn)，采集被檢藏豬直腸棉拭子1 200頭份，保存于1 mL營養(yǎng)肉湯的滅菌醫(yī)用配離心管，車載冰箱4℃保存。標(biāo)明樣品采集時(shí)間、地點(diǎn)、編號。

采樣原則：每個(gè)采樣點(diǎn)分別采集1歲以上藏豬直腸棉拭子40頭份、斷奶仔藏豬60頭份。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸桿菌（ATCC25922）購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基及配制 普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。稱取營養(yǎng)肉湯粉末18 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15 min，待冷至常溫，備用。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。稱取麥康凱瓊脂粉末55 g，加入蒸餾水或去離子水1 L，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15 min。待培養(yǎng)基冷至50～55℃傾注滅菌平皿，待凝固后，備用。

科瑪嘉?大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（ECC）購于博賽生物技術(shù)股份有限公司。取瓶內(nèi)干粉37.3 g溶于1 000 mL去離子水的潔凈三角瓶中，充分?jǐn)嚢杌靹?，高壓滅菌?21℃，15 min）。加熱后的培養(yǎng)基冷卻至45～50℃，輕輕地?fù)u動均勻，傾注平皿，使其凝固，晾干備用。

伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB）購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。稱取伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基粉末42.5 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板購于上海凡儀科技發(fā)展有限公司。

1.1.4 大腸桿菌API-20E生化鑒定試紙條 生化反應(yīng)鑒定試紙條API-20E購于法國梅里埃生物技術(shù)有限公司，用于腸桿菌屬細(xì)菌的快速生化鑒定。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離和初步鑒定 用無菌接種環(huán)蘸取少量被檢藏豬直腸棉拭子的營養(yǎng)肉湯，劃線接種在麥康凱瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，挑取紅色或粉紅色的單菌落（每個(gè)樣本挑取一個(gè)），在LB肉湯中37℃培養(yǎng)18 h左右，取菌液劃線接種于ECC顯色培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)，呈現(xiàn)光滑、邊緣整齊、直徑為1～2 mm的藍(lán)色或綠色圓形菌落可初步判斷為大腸桿菌[4]。

1.2.2 大腸桿菌API-20E試紙條的生化鑒定 將少量可疑細(xì)菌接種于API-20E試紙條，培養(yǎng)20 h左右，加入相應(yīng)顯色試劑后觀察其顏色的變化，根據(jù)說明表判讀反應(yīng)，參照分析圖索引和APLAB PLus軟件得到鑒定結(jié)果。

1.2.3 致病性試驗(yàn) 將生化反應(yīng)特征符合大腸桿菌的菌株接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h后，分別腹腔接種小白鼠，0.2 mL/只，觀察存活情況。剖檢死亡小白鼠，取其臟器用伊紅美蘭培養(yǎng)基進(jìn)行種菌回收試驗(yàn)，其培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)均符合大腸桿菌，判定為致病性大腸桿菌[3，5]。

1.2.4 大腸桿菌O抗原血清型鑒定 將經(jīng)分離鑒定為致病性大腸桿菌的菌株接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行純培養(yǎng)，用少量0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌落，制成濃稠菌懸液，121℃高壓滅菌2 h，破壞K抗原，冷卻后用微量移液器吸取25 μL與等量標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，5 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)，同時(shí)以生理鹽水作對照，觀察有無自凝現(xiàn)象[5-6]。

1.3 藥敏試驗(yàn)

青霉素、慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、先鋒霉素9種藥，按照常規(guī)藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作，并根據(jù)抑菌圈直徑（Ф）判定藥物敏感性，Ф≥20 mm為高度敏感，15 mm≤Ф＜20 mm為中度敏感，Ф＜15 mm為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株鑒定結(jié)果

從拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)采集被檢藏豬直腸棉拭子1 200頭份的樣品中，共分離鑒定出99株致病大腸桿菌菌株。其培養(yǎng)特性及染色、生化反應(yīng)特征為：革蘭氏染色均為革蘭氏陰性桿菌；在普通肉湯中呈均勻混濁，液面有菌膜，管底有白色沉淀，振蕩呈云霧狀散開；普通瓊脂平板上生長呈灰白色、半透明、表面隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的圓形菌落，直徑1～3 mm；麥康凱培養(yǎng)基上生長呈粉紅色菌落；ECC培養(yǎng)呈藍(lán)色；伊紅美蘭培養(yǎng)基上生長呈紫黑色帶金屬光澤菌落；API-20E試紙條的生化鑒定為大腸桿菌。

2.2 菌株血清型鑒定結(jié)果

用50種O抗原血清對99株分離株進(jìn)行血清型鑒定，除14株未鑒定出血清型外，其余85株血清型 分 屬 于 O21（15/85）、O9（12/85）、O101（9/85）、O18（9/85）、O85（9/85）等22個(gè)血清型（表1）。其中O21、O101、O18、O9、O85有54株，共占所鑒定分離菌株的63.53%（54/85），這幾種血清型均為拉薩-林芝公路沿線目前流行的主要血清型。

表1 豬大腸桿菌分離菌株血清型鑒定結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拉薩-林芝公路沿線蔡公堂鄉(xiāng)、章多鄉(xiāng)、甲瑪鄉(xiāng)、工卡鎮(zhèn)、扎西崗鄉(xiāng)、日多鄉(xiāng)、加興鄉(xiāng)、金達(dá)鎮(zhèn)、巴河鎮(zhèn)、百巴鎮(zhèn)、更章門巴民族鄉(xiāng)、八一鎮(zhèn)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)分離獲得的藏豬大腸桿菌致病菌株對藥物的敏感性差異較小。對卡那霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、先鋒霉素4種藥高度敏感，對慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林中度敏感，對青霉素耐藥。其中77.13%的菌株對青霉素耐藥，對慶大霉素、諾氟沙星、左氟沙星、阿莫西林耐藥的菌株分別為19.47%、18.10%、17.77%和15.39%。

3 討論

大腸桿菌引起的仔豬下痢仍然是導(dǎo)致藏豬養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益較差的重要原因之一，長期困擾著藏豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在當(dāng)?shù)孬F醫(yī)指導(dǎo)下，經(jīng)藥物治療后雖然仔豬死亡率不高，但常引起發(fā)病仔豬生長發(fā)育遲緩、生產(chǎn)能力低下，給拉薩-林芝公路沿線藏豬養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

77.13%的菌株對青霉素耐藥，說明拉薩-林芝公路沿線藏農(nóng)牧民經(jīng)常盲目給發(fā)病豬使用青霉素，致使大腸桿菌產(chǎn)生耐藥。對發(fā)病藏豬，在確診的基礎(chǔ)上，與相關(guān)教學(xué)科研單位協(xié)作，通過藥敏試驗(yàn)，有目的、有針對性地用藥，且用藥應(yīng)有足夠療程和劑量，盡量減少耐藥菌株產(chǎn)生[5，7]。

選擇適合本地血清型的大腸桿菌疫苗，方能有效預(yù)防本病發(fā)生。在血清型鑒定中發(fā)現(xiàn)，O21、O101、O18、O9、O85有 54株，共占所鑒定分離菌株的 63.53%（54/85），即這幾種血清型是拉薩-林芝公路沿線目前流行的主要血清型。不同區(qū)域流行菌株血清型差異較大，而且同一藏豬養(yǎng)殖較為集中的鄉(xiāng)鎮(zhèn)也存在多種血清型，因此，在大腸桿菌的免疫預(yù)防中，應(yīng)充分考慮其血清型的多樣性、易變性[7]，尤其是藏豬養(yǎng)殖較為集中的鄉(xiāng)鎮(zhèn)最好每年進(jìn)行一次血清分型鑒定，以便有針對性地進(jìn)行免疫。

[1]強(qiáng)巴央宗，謝莊，田發(fā)益.高原藏豬現(xiàn)狀與保種策略[J].中國畜牧雜志，2001，37（6）：46-47.

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[3]陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].第6版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016：108-117.

[4]李鵬.藏豬源大腸桿菌和腸球菌耐藥性調(diào)查及其耐藥機(jī)制的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[5]謝永平，楊威，陳澤祥，等.廣西地區(qū)豬大腸桿菌血清型調(diào)查及耐藥性檢測[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（4）：380-382.

[6]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：78-86.

[7]嚴(yán)亮.大腸桿菌多重耐藥株的體外誘導(dǎo)初步研究[J].畜牧與飼料科學(xué)，2015，36（4）：15-17.