張雪娜　賈海濱　張麗秀

摘要：利用富集培養(yǎng)法從河北省典型煤礦區(qū)土壤中分離到1株4環(huán)高環(huán)芳烴（HMW-PAHs）降解菌，經(jīng)形態(tài)特征觀察和18S rRNA序列分析確定該菌株為鐮刀菌屬（Fusarium sp.），命名為Y15。通過室內(nèi)搖瓶和土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，研究了其對(duì)4環(huán)HMW-PAHs的降解性能。結(jié)果表明，室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)7 d后，Y15接種量為100 mL/L時(shí)，對(duì)初始濃度為 10 mg/L 的芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、[XCZ60.tif]（Chry）的降解效率分別為52.94%、32.14%、33.93%。其中，對(duì)Pyr的降解率隨初始濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，在40 mg/L時(shí)降解率最高，為69.67%。Y15接種在PAHs污染的土壤中，經(jīng)30 d培養(yǎng)試驗(yàn)，Y15對(duì)3種高環(huán)芳烴Pyr、BaA、Chry的總降解率為13.15%。在3種PAHs中，Y15對(duì)Pry的降解率顯著高于對(duì)BaA、Chry的降解率（P<0.05）。從土壤酶活性變化規(guī)律看，與添加滅活菌液的對(duì)照組相比，添加菌液處理的土壤多酚氧化酶和過氧化物酶活性明顯降低。綜上所述，該菌株是1株能以4環(huán)HMW-PAHs為唯一碳源且具有高效降解功能的潛在降解菌。

關(guān)鍵詞：芘；苯并蒽；[XCZ60.tif]；生物降解；鐮刀菌

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0282-04

多環(huán)芳烴 （polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指由2個(gè)或2個(gè)以上苯環(huán)以角狀、線狀或簇狀組成的一類持久性有機(jī)污染物，在環(huán)境中普遍存在，因具有致畸、致癌、致突變的性質(zhì)而受到人們的重視[1-2]。其中，4環(huán)及4環(huán)以上的高環(huán)PAHs（HMW-PAHs），因其疏水性、親脂性、穩(wěn)定性更強(qiáng)，更不易被降解[3-4]，對(duì)自然環(huán)境和人體健康均造成極大威脅，其中，4環(huán)PAHs 中的芘（Pyr）、[XCZ60.tif]（Chry）、苯并[a]蒽（BaA）屬于美國(guó)環(huán)境保護(hù)局列入優(yōu)先控制污染中的16種PAHs。

目前，微生物修復(fù)是去除環(huán)境中PAHs的主要方式，微生物系統(tǒng)、多環(huán)芳烴污染物的類型、污染區(qū)域的地質(zhì)化學(xué)條件是解決PAHs污染問題的3個(gè)重要條件，在已知污染物類型和污染區(qū)域條件的基礎(chǔ)上，微生物系統(tǒng)成為PAHs生物降解的主導(dǎo)者[5]。從污染土壤中篩選高效降解菌是開展微生物修復(fù)的基礎(chǔ)。白鵬等從石油污染區(qū)土壤分離篩選得到1株芘高效降解菌菌株，菌株ZQ5在30 ℃振蕩培養(yǎng)16 d后對(duì) 150 mg/L 芘的降解率為90.31%[6]。李曉明等從焦化廠土壤中篩選出芘降解菌群，還有少量菌種篩選自海洋沉積物或污泥[7]，因此，在不同的典型污染土壤中進(jìn)行篩菌工作對(duì)補(bǔ)充菌種資源庫及修復(fù)特定環(huán)境下的PAHs污染問題尤為重要。目前為止，從煤礦區(qū)受PAHs長(zhǎng)期污染的農(nóng)田土壤中篩選降解菌株的工作尚未開展，可加強(qiáng)研究。同時(shí)，近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)高分子量PAHs的微生物降解研究較少，而能夠以高分子量PAHs為唯一碳源的微生物資源更少[8]。

因此，本研究擬通過富集培養(yǎng)，從典型煤礦區(qū)多環(huán)芳烴長(zhǎng)期污染土壤中篩選高分子量PAHs的高效降解菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和18S rRNA序列分子生物學(xué)分析，對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，并通過室內(nèi)搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)和室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗(yàn)考察其對(duì)Pyr、BaA、Chry的降解能力，為微生物修復(fù)4環(huán)HMW-PAHs的環(huán)境提供資源保障和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試菌株為筆者課題組前期富集、篩選、馴化、待鑒定的菌株。

供試土壤采自河北省典型煤礦區(qū)的農(nóng)田污染場(chǎng)地，區(qū)內(nèi)分布有焦化廠和鋼鐵廠等生產(chǎn)企業(yè)，土壤樣品為受PAHs長(zhǎng)期污染的老化土壤，Pyr、BaA、Chry的總含量達(dá)2 019.23 mg/kg。取 0～10 cm表層污染土壤，遮光風(fēng)干后，過1 mm篩，混合均勻后，在4 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，其基本化學(xué)性質(zhì)如表1所示。供試土壤樣品的pH值為7.46。

多環(huán)芳烴芘（Pyr）、苯并[a]蒽（BaA）、[XCZ60.tif]（Chry），均為分析純。

無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：0.20 g MgSO4·7H2O、0.02 g CaCl2·2H2O、0.01 g FeSO4·7H2O、0.40 g KH2PO4、0.60 g Na2HPO4、0.02 g MnSO4·H2O、1.00 g NH4NO3、1.00 L蒸餾水（無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入 15～20 g瓊脂）。

高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基：2.000 g可溶性淀粉、0.050 g氯化鈉、0.110 g硝酸鉀、0.050 g磷酸氫二鉀、0.050 g硫酸鎂、0001 g硫酸亞鐵、1.500～2.000 g瓊脂、100 mL蒸餾水，pH值為7.4～7.6（高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基在高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上去掉瓊脂）。

1.24環(huán)HMW-PAHs降解菌的篩選

富集：于100 mL已滅菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中放入5 g農(nóng)田污染場(chǎng)地新鮮的土壤樣品，150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng) 24 h 獲得富集菌液，取1 mL富集菌液接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

篩選與純化：將上述在高氏一號(hào)培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的富集菌液經(jīng)含PAHs的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并經(jīng)多次轉(zhuǎn)接純化后獲得多株純化菌株。

馴化：將已篩選出的所有純菌接種到表層含120 μg 4環(huán)PAHs的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行沖擊，30 ℃下培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，得到目標(biāo)降解菌株，將所述目標(biāo)降解菌株接種到表層含12、24、48 μg 4環(huán)HMW-PAHs的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中進(jìn)行逐級(jí)馴化，30 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d后，生長(zhǎng)良好，將馴化后的菌株進(jìn)行鑒定，并用甘油冷凍保存于-70 ℃冰箱，備用。endprint

1.34環(huán)HMW-PAHs降解菌的鑒定

1.3.1形態(tài)觀察及鑒定

將已充分活化的菌株接種到高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落，并在高倍顯微鏡下觀察菌株孢子、菌絲的形態(tài)學(xué)特征。

1.3.2菌株的分子生物學(xué)鑒定

以菌株基因組DNA為模板，用真菌核糖體rRNA區(qū)通用引物（ITS1、ITS4）進(jìn)行18S rRNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增片段回收、測(cè)序，根據(jù)18S rRNA的測(cè)序結(jié)果，利用Blast軟件在GenBank中與其他已測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株的18S rRNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.4菌株對(duì)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中Pyr、BaA、Chry 的降解特性

1.4.1菌懸液制備

取1 mL馴化后保存的菌液，接種于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后得到目標(biāo)菌株，將其接種于100 mL高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)48 h后得到富集菌液。

1.4.2菌株對(duì)Pyr、BaA、Chry的降解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在100 mL三角瓶中加入18 mL無機(jī)鹽溶液滅菌后，添加一定量4環(huán)PAHs單體母液，待丙酮揮發(fā)后，接入10%的富集菌液，使PAHs單體Pyr、BaA、Chry的終濃度均為10 mg/L，以不添加富集菌液的處理作為對(duì)照組，均在150 r/min、30 ℃搖床中遮光振蕩培養(yǎng)7 d，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)方案如表2所示。

1.6樣品測(cè)定指標(biāo)及方法[HJ1.45mm]

土壤基本理化性質(zhì)：采用土壤農(nóng)化常規(guī)分析法[9]測(cè)定。

PAHs無機(jī)鹽溶液測(cè)定指標(biāo)：Pyr、BaA、Chry測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10-12]。在三角瓶中加入20 mL色譜純正己烷，超聲提取5 min后，使粘在壁上的PAHs全部浸到正己烷溶液中，再將三角瓶置于250 r/min振蕩器中，振蕩提取40 min后，再次超聲提取5 min，靜置分層后吸取1 mL上層正己烷溶液轉(zhuǎn)移至2 mL頂空進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

土壤中HMW-PAHs測(cè)定指標(biāo)及其分析方法：土壤中PAHs含量以風(fēng)干質(zhì)量計(jì)量，稱取20 g土壤樣品及10 g無水硫酸鈉，混合均勻后，加入20 μL替代物（濃度為20 μg/mL的氘代三聯(lián)苯與4-溴-2氟聯(lián)苯的正己烷溶液），用丙酮與正己烷體積比為1 ∶1的提取劑索氏提取12 h，并經(jīng)過干燥、濃縮、凈化、再次濃縮后用正己烷定容至1 mL，待測(cè)[12-13]。

土壤酶活性測(cè)定指標(biāo)及其分析方法：土壤多酚氧化酶活性采用鄰苯三酚比色法測(cè)定，以1 g風(fēng)干土壤樣品2 h內(nèi)生成的紫色沒食子素的毫克數(shù)表示；土壤過氧化物酶活性測(cè)定與多酚氧化酶活性的測(cè)定方法相同[14]。

儀器：氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)用，氣相色譜儀為安捷倫6890，質(zhì)譜儀為美國(guó)HP5972系列。

質(zhì)量控制：回收率和檢測(cè)線的測(cè)定參考EPA標(biāo)準(zhǔn)方法，回收率測(cè)定采用土壤基質(zhì)加標(biāo)法[15]。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

無機(jī)鹽溶液中多環(huán)芳烴降解率=（對(duì)照組PAHs含量-試驗(yàn)組PAHs含量）/對(duì)照組PAHs含量×100%。

土壤中HMW-PAHs的降解率Rs=（C0-Ct）/C0×100%。其中，C0為對(duì)照組土壤中HMW-PAHs的含量，Ct為試驗(yàn)組土壤中HMW-PAHs的含量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.14環(huán)HMW-PAHs降解菌株的形態(tài)鑒定與18S rRNA分子生物學(xué)鑒定

菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上30 ℃培養(yǎng) 48 h 后，培養(yǎng)基無色，菌絲生長(zhǎng)密致，菌落的表面棉絮狀；分生孢子呈鐮刀形，分生孢子座為淺紫色，0～3個(gè)分隔，多數(shù)無隔。

對(duì)菌株的18S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得大小約500 bp的產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物回收后進(jìn)行測(cè)序，得到18S rRNA的序列為526 bp（圖1）。利用Blast軟件在GenBank中與其他標(biāo)準(zhǔn)菌株的18S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，該菌株18S rRNA序列與鐮刀菌屬真菌的18S rRNA序列相似性高達(dá)99%。結(jié)合菌株的形態(tài)特征分析與18S rRNA的結(jié)果，鑒定此菌株為鐮刀菌屬（Fusarium sp.），命名為Y15。

2.2Y15菌株對(duì)無機(jī)鹽培養(yǎng)液中Pyr、 BaA、Chry的降解特性

將Y15菌液加入分別含有10 mg/L Pyr、 BaA、Chry的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，7 d后測(cè)定Y15對(duì)3種HMW-PAHs的降解效果。由圖2可知，Y15菌液對(duì)Pyr、 BaA、Chry的降解率分別為5294%、32.14%、33.93%。經(jīng)檢驗(yàn)，Y15菌液對(duì)Pyr的降解率顯著高于對(duì)BaA、Chry的降解率（P<0.05），說明Y15菌株能夠分別以Pyr、BaA、Chry為唯一碳源和能源進(jìn)行代謝繁殖。

由圖3可知，隨著Pyr初始濃度的升高，Y15菌株對(duì)Pyr的降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)Pyr的濃度為40 mg/L時(shí)降解效果較好，降解率高達(dá)69.67%，顯著高于對(duì)其余兩者的降解率（P<0.05），分別是其余兩者的1.32、2.01倍。由此可見，Y15菌株對(duì)高濃度的HMW-PAHs有較強(qiáng)的耐受能力。

2.3Y15菌株對(duì)老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry的降解效果

由圖4可知，添加Y15菌液的處理中Pyr、 BaA、Chry分別降低了15.02%、11.50%、12.20%，Y15菌株對(duì)4環(huán) HMW-PAHs的總降解率達(dá)到了13.15%。根據(jù)單體去除效果可知，Y15對(duì)土壤中Pyr的降解效果顯著好于對(duì)BaA、Chry的降解效果（P<0.05），這說明Y15菌液對(duì)老化污染土壤中Pyr、 BaA、Chry均有一定的降解能力，且對(duì)Pyr的降解能力較強(qiáng)。endprint

2.4不同處理下土壤酶活性的顯著性分析

由表5可知，與對(duì)照相比，加入Y15菌液后，土壤多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性顯著降低。對(duì)照處理土壤多酚氧化酶活性是施加Y15菌液處理中多酚氧化酶活性的1.62倍，與對(duì)照組處理相比，施加Y15菌液處理組過氧化物酶活性降低了23.83%。

3結(jié)論與討論

經(jīng)過對(duì)典型煤礦區(qū)土壤中多環(huán)芳烴含量的檢測(cè)，證明土壤已經(jīng)受到高濃度多環(huán)芳烴的嚴(yán)重污染[16]。在本研究中，在典型煤礦區(qū)土壤中分離到1株可分別以Pyr、 BaA、Chry為唯一碳源和能源的降解菌Y15菌株，經(jīng)形態(tài)觀察和18S rRNA分子生物學(xué)分析，初步鑒定其屬于鐮刀菌屬。該菌株能夠利用、降解多種HWM-PAHs。目前，能夠降解HMW-PAHs的菌株一般多為細(xì)菌[17-21]，真菌中對(duì)白腐真菌研究最多[22-24]，對(duì)鐮刀菌屬降解HMW-PAHs的研究也僅見零星報(bào)道[25]。

在本研究搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)中，7 d后Y15菌液對(duì)初始濃度為10 mg/L的Pyr、 BaA、Chry降解率達(dá)52.94%、32.14%、33.93%。而Ortega-González等以50 mg/L的Pyr為唯一碳源，14 d后，鐮刀菌屬對(duì)Pyr的降解率為51.32%[25]；絲狀真菌宛氏擬青霉30 d對(duì)BaA的單一體系的降解率為1718%[26]。這可能是由于菌株篩選地點(diǎn)不同其降解PAHs的能力存在差異，也可能是由搖瓶試驗(yàn)培養(yǎng)的環(huán)境、時(shí)間不同所致。從煤礦區(qū)土壤篩選的鐮刀菌屬Y15菌株是一種優(yōu)良的4環(huán)HMW-PAHs降解菌，對(duì)4環(huán)HMW-PAHs具有很好的降解潛力。此外，Y15對(duì)較高濃度及較低濃度的Pyr均有一定的降解效果，但是降解效果顯著低于最適降解濃度（P<0.05），這與其他學(xué)者的研究結(jié)果[6，27-28]一致?？赡苁怯捎赮15將Pyr作為唯一碳源，Pyr濃度過低則菌體對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)作用會(huì)影響其生長(zhǎng)，或者是 PAHs濃度低時(shí)不能快速誘導(dǎo)產(chǎn)生裂解酶[27]；而過高濃度的Pyr以及Pyr代謝的中間產(chǎn)物的累積可能對(duì)降解菌起到了一定的毒害作用[6，28]，抑制了Y15的生長(zhǎng)。

土壤培養(yǎng)試驗(yàn)中，通過向滅菌老化污染土壤的土壤樣品中添加鐮刀菌屬Y15菌株的菌液以提高 PAHs 的降解效率，Y15菌液對(duì)Pyr、 BaA、Chry降解率分別為15.02%、1150%、12.20%，對(duì)4環(huán)PAHs的降解率為13.15%。Potin等將鐮刀菌屬等降解菌加入到未滅菌老化土壤中，30 d后，鐮刀菌屬對(duì)4環(huán)PAHs的降解率為22%[29]，這可能是由土壤的理化性質(zhì)、菌種、接菌量不同所致[30]，也可能是因?yàn)殓牭毒褐袪I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加入未滅菌土壤中影響了土著微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高PAHs的降解效果[31]。就土壤酶活性而言，多酚氧化酶活性與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.05），與Liu等的結(jié)論[32]一致。

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