宋紅霞，薛曉東

1重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥理教研室，重慶 萬州 404000；2重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院皮膚科

銀屑病是一種常見易復(fù)發(fā)的慢性炎癥性皮膚病，目前該病病因不明，近年來多認(rèn)為是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾?。?］。消銀湯源自筆者導(dǎo)師多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，后根據(jù)自身臨床體會(huì)加減而成。為進(jìn)一步證實(shí)其療效及作用機(jī)制，現(xiàn)采用消銀湯干預(yù)銀屑病小鼠動(dòng)物模型，并檢測(cè)小鼠血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素10(IL-10)的水平，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 昆明種雌性小鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(渝)2012-0001；小鼠在溫度16～26℃，相對(duì)濕度40%～70%的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 藥物 消銀湯藥物組成：黃芩10 g，生地黃15 g，牡丹皮 12 g，赤芍 15 g，半枝蓮 30 g，白花蛇舌草 15g，槐花 10g，紫草 10g，玄參 15g，丹參 15g，雞血藤15 g，甘草6 g。制備方法：稱取各藥材，用水煎煮2次，煎出液合并，濃縮到每劑藥168 mL。消銀湯的人體推薦攝入量為每天168 g生藥，相當(dāng)于2.8 g/(kg·d)生藥(成人以60 kg計(jì))。

1.3 主要試劑及設(shè)備 甲氨蝶呤片(上海信誼藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20130403)；秋水仙堿注射液(吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司，批號(hào)：20130915)；己烯雌酚注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：130203)；小鼠 TNF-α及 IL-10 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：201310)；光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；LP-400型酶標(biāo)儀(法國(guó)巴斯德公司)。

1.4 消銀湯對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響［2-4］取昆明種雌性小鼠60只，隨機(jī)選取10只作為空白對(duì)照組，其余每只小鼠腹腔注射0.2 mg己烯雌酚，1次/d，連續(xù)注射3天，使小鼠處于雌激素期。3天后隔天腹腔注射己烯雌酚(0.2mg/只)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。第4天將模型小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型組及甲氨蝶呤組(2 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量，用生理鹽水配制成所需濃度)，消銀湯高(69.0 g/kg)、中(34.5 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量)、低(17.3 g/kg)劑量組，各組灌胃給藥，每天2次，連續(xù)14天，給藥容積為35 mL/kg?？瞻讓?duì)照組和模型組給予等容積的生理鹽水。末次給藥2小時(shí)后，每只小鼠腹腔注射秋水仙堿2 mg/kg，使細(xì)胞有絲分裂周期停滯于有絲分裂中期，便于計(jì)數(shù)。6小時(shí)后摘小鼠眼球取血，室溫靜置15分鐘，3 000 r/min離心15分鐘后分離血清，置于-70℃保存，用于TNF-α，IL-10的濃度測(cè)定。處死小鼠后，切取陰道組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，HE染色，光鏡下觀察有絲分裂情況，計(jì)數(shù)300個(gè)基底細(xì)胞中的有絲分裂數(shù)，折算出有絲分裂指數(shù)(即每100個(gè)基底細(xì)胞中的有絲分裂數(shù))。比較各組小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)，并作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清TN F-α，IL-10 從-70℃冰箱取出各組血清樣本，恢復(fù)至室溫，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消銀湯對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響 消銀湯高、中、低劑量對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂有明顯的抑制作用，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且呈良好的量效關(guān)系。甲氨蝶呤也能明顯抑制小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂(P＜0.01)。消銀湯中、低劑量對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的抑制作用與甲氨喋呤相近(P＞0.05)，消銀湯高劑量對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的抑制作用較甲氨喋呤強(qiáng)(P＜0.05)，見表1。

表1 各組小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂情況(±s)

表1 各組小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂情況(±s)

注：*表示與模型組比較，P＜0.01；#表示與甲氨蝶呤組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) 有絲分裂指數(shù)空白對(duì)照組 10 - 10.47±2.31*模型組 10 - 19.81±3.15消銀湯高劑量組 10 69.0 12.79±1.34*#消銀湯中劑量組 10 34.5 15.33±2.19*消銀湯低劑量組 10 17.3 16.00±2.92*甲氨蝶呤組 10 0.002 15.06±2.00*

2.2 消銀湯對(duì)小鼠血清TN F-α或IL-10含量的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α的含量明顯升高(P＜0.01)，IL-10的含量明顯降低(P＜0.01)；與模型組相比，消銀湯高、中劑量組小鼠血清中 TNF-α的含量明顯降低(P＜0.01)，IL-10的含量均有升高(P＜0.05)，見表2。

表2 消銀湯對(duì)小鼠血清TN F-α、IL-10含量的影響(±s)

表2 消銀湯對(duì)小鼠血清TN F-α、IL-10含量的影響(±s)

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，#表示P＜0.01；與甲氨蝶呤組比較，○表示P＜0.05，△表示 P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) TN F-α/(ng·m L-1) IL-10(ng·m L-1)空白對(duì)照組 10 - 1.64±0.84# 7.30±1.58#模型組 10 - 3.80±0.77 3.35±1.79消銀湯高劑量組 10 69.0 1.96±0.66#△ 6.72±2.18#消銀湯中劑量組 10 34.5 2.27±0.49#○ 5.63±2.08*消銀湯低劑量組 10 17.3 3.09±0.76 3.51±1.48○甲氨蝶呤組 10 0.002 3.20±1.18 5.31±1.98

3 討論

銀屑病俗稱“牛皮癬”，是一種以紅斑鱗屑為主的慢性炎癥性皮膚病，特征性損害為紅色丘疹或斑塊上覆有多層銀白色鱗屑［5-7］。本病病程較長(zhǎng)，病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前銀屑病發(fā)病機(jī)制主要有遺傳因素、感染因素、免疫因素、神經(jīng)精神因素、內(nèi)分泌因素等［8］。近年有研究［9］表明銀屑病存在著免疫異常，而細(xì)胞因子作為免疫調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)在銀屑病的發(fā)病中起重要作用。TNF-α是一種與銀屑病免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子，它不僅能夠誘導(dǎo)皮膚內(nèi)黏附因子表達(dá)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，而且能夠促進(jìn)朗格漢斯細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)其活化T細(xì)胞的能力［10］。IL-10是一種較強(qiáng)的抗炎因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-10可使銀屑病表皮厚度變薄，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和分化［11］。IL-10在IL-4輔助下可激活Th 2型細(xì)胞并抑制Th1型細(xì)胞功能，在IL-10相對(duì)或絕對(duì)缺乏的情況下會(huì)導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生［12］。

雌激素期的小鼠陰道上皮細(xì)胞增殖活躍，有絲分裂增加，并且上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換加快，可以模擬銀屑病表皮增殖過快的特點(diǎn)，通過比較小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)較好地評(píng)價(jià)藥物抑制細(xì)胞有絲分裂的作用［13］。該模型被作為篩選抗銀屑病藥物的常用模型［14］。

本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠陰道上皮模型，隨后給予不同劑量的消銀湯進(jìn)行干預(yù)，考察消銀湯對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂及血清細(xì)胞因子TNF-α、IL-10的影響。結(jié)果顯示消銀湯各劑量組均可明顯抑制銀屑病樣小鼠陰道上皮細(xì)胞的有絲分裂，高、中劑量可明顯降低TNF-α的含量，升高IL-10的水平，提示消銀湯對(duì)銀屑病小鼠具有的治療作用可能與其抑制表皮細(xì)胞增殖并降低血清中TNF-α水平，升高IL-10水平有關(guān)。

［1］盛國(guó)榮，謝勇，劉海琴.退銀湯聯(lián)合窄譜中波紫外線治療尋常型銀屑病的療效及對(duì)外周血相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34(7)：576-580.

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