何凱柯+王子璇+李潤(rùn)龍

水稻紋枯病是南方水稻病害之首。目前以化學(xué)農(nóng)藥為主的防治手段普遍存在抗藥性、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)赝寥牢⑸锶郝涞亩鄻有裕焕谵r(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

湖南湘潭縣中路鋪鎮(zhèn)鳳形山屬丘陵地帶，四季分明，雨量豐沛，空氣質(zhì)量好。我們從山坡土壤中分離鑒定了四株芽孢桿菌：短小芽孢桿菌ZN-2、海洋芽孢桿菌ZN-3、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌ZN-4、蠟樣芽孢桿菌ZN-6。

當(dāng)?shù)卮迕裢且患舅疽患居筒溯喎N，可利用四株芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病和油菜菌核病做生防試驗(yàn)，篩選對(duì)有機(jī)水稻進(jìn)行生物防治高效、無(wú)副作用的有益微生物，為有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和環(huán)境及食品安全奠定基礎(chǔ)。

一、鳳形山有益微生物對(duì)水稻紋枯病的抑菌活性

1.供試菌種

生防菌株：短小芽孢桿菌ZN-2、海洋芽孢桿菌ZN-3、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌ZN-4、蠟樣芽胞桿菌ZN-6。

致病真菌：水稻紋枯病菌、油菜菌核病菌（立枯絲核菌）。

2.試驗(yàn)步驟

將四種活化36h的生防菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180r/min下?lián)u培36h，至菌懸液終濃度達(dá)到1.0×109 CFU·mL-1，即為四種生防菌發(fā)酵液制劑。所得四種培養(yǎng)液分別在12 000rmp離心20min，取上清液進(jìn)一步過(guò)濾獲得四種無(wú)菌提取液制劑。

將水稻紋枯病和油菜菌核病菌接種到PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的病原真菌菌碟0.5 mm置于平板中央，在與平板中央和平板邊緣等距離位置放置5mm直徑濾紙，承載菌懸液并防止其流散。然后在濾紙上滴加150μL制備好的生防菌懸液，以添加無(wú)菌水作為對(duì)照組。接種后的平板置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照平板中菌絲長(zhǎng)滿平板時(shí)測(cè)量抑菌圈直徑。

3.試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌ZN-4對(duì)油菜菌核病菌有顯著的抑菌活性，ZN-2、ZN-3、ZN-6對(duì)油菜菌核病菌均無(wú)明顯的抑制效果。

而短小芽孢桿菌ZN-2對(duì)水稻紋枯病菌有顯著的抑制作用，ZN-3、ZN-4、ZN-6對(duì)水稻紋枯病菌均無(wú)明顯的抑制效果。

二、ZN-2與ZN-4混合無(wú)菌提取液對(duì)水稻紋枯病的抑制活性

1.制備防治制劑

將活化好的ZN-2與ZN-4接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩培養(yǎng)24h 至48h。待菌細(xì)胞濃度均達(dá)107cfu/mL以上，以等體積比例混合配成培養(yǎng)液，即為混合菌發(fā)酵液制劑。

所得培養(yǎng)液在12 000rmp離心20min，取上清液進(jìn)一步用濾器過(guò)濾（濾膜孔徑為0.22um）獲得無(wú)菌提取液制劑。

2.混合菌發(fā)酵液制劑對(duì)水稻紋枯病的抗菌活性檢測(cè)

在PDA平板中間接入培養(yǎng)3天至5天的直徑為5mm植物病原真菌水稻紋枯病菌碟，28℃恒溫培養(yǎng)。36h后，將混合菌液分別接種在距離真菌菌落中央2cm處，使其成為菌落。繼續(xù)培養(yǎng)，定期檢查抑制效果。

3.無(wú)菌提取液制劑對(duì)水稻紋枯病的抗菌活性檢測(cè)

在PDA平板上對(duì)稱打4個(gè)直徑為5mm的孔洞，其中兩個(gè)孔滴入20uL混合菌過(guò)濾液，另外兩個(gè)孔滴入200uL無(wú)菌水作對(duì)照。在培養(yǎng)基上鋪一層無(wú)菌玻璃紙，以防止其揮發(fā)。在平板中央移入水稻紋枯病菌碟，28℃下培養(yǎng)，觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。

4.不同濃度無(wú)菌提取液制劑對(duì)水稻紋枯病菌的影響

將混合菌無(wú)菌提取液二倍稀釋液按1%、2%、4%、8%、16%濃度混勻至溶化的PDA培養(yǎng)基中，制備平板，以加等體積的無(wú)菌水處理為對(duì)照，每種處理重復(fù)三次。晾干后在平板上鋪一層滅菌玻璃紙，并在平板中央接種5mm水稻紋枯病菌碟，25℃恒溫培養(yǎng)。待對(duì)照平板長(zhǎng)滿菌絲后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

試驗(yàn)表明，無(wú)菌提取液對(duì)水稻紋枯病菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。從菌落直徑來(lái)看，當(dāng)添加濃度達(dá)到8%時(shí)，抑制率達(dá)到50%以上；當(dāng)添加濃度為2%時(shí)，對(duì)病菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但已明顯下降。

三、總結(jié)

綜上所述，短小芽孢桿菌ZN-2及其與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌ZN-4的混合無(wú)菌提取液能有效防治有機(jī)水稻紋枯病，有作為生物農(nóng)藥的良好潛力。但如何保證短小芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌及其混合無(wú)菌提取液在田間試驗(yàn)中的穩(wěn)定性，還需要進(jìn)一步研究。（指導(dǎo)老師：蔣銀生段家鐵）endprint