浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

麥纖散是浙江中醫(yī)藥大學(xué)鄭紅斌教授研究的一種治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗方[1]，新麥纖散復(fù)方制劑是在麥纖散（麥芽纖維、山藥、茯苓）的基礎(chǔ)上又配伍三七、白及所組成，主要針對潰瘍性結(jié)腸炎的瘀毒病機，進一步改善患者腹痛、瀉下粘液膿血的癥狀，緩解腸道炎癥并縮短潰瘍愈合時間。其中的麥芽、山藥、茯苓是具有藥食兩用特性的天然藥物，治療脾胃病歷史悠久[2-4]。方中將麥芽列為君藥，山藥、茯苓為臣藥，以治本病脾虛之本；而又佐使以三七、白及解決其瘀毒之標，全方共奏健脾固腸、止血愈瘍、消腫止痛、收斂生肌之效。

既往已有研究采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定三七中的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1[5]、白及中的Coelonin[6]、山藥中的薯蕷皂苷[7]和茯苓中茯苓酸的含量[8]，但同時測定以上5種成分含量的方法尚未見于文獻報道。為了完善新麥纖散的質(zhì)量控制，有必要建立一種對多個中藥中多種成分的含量進行同步分析的測定方法。本研究采用反相高效液相色譜技術(shù)（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）建立同時測定以上5種有效成分含量的方法，為完善新麥纖散的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 Agilent1200高效液相色譜儀、G1329A型自動進樣器、二極管列陣檢測器（diode array detector，DAD）、G1311A 型四元泵、Agilent 1200色譜工作站均為美國 Agilent公司產(chǎn)品；AG135電子分析天平購于瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀購于昆山市超聲儀器有限公司；粉碎機購自廣州德章機械設(shè)備有限公司，Milli-Q超純水機為美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 試劑及藥品 甲醇（色譜純，購于德國MERCK公司，批號：20151016），乙腈（色譜純，購于德國MERCK公司，批號：20150921），甲醇（分析純，購于江蘇永華化學(xué)科技有限公司，批號：20120409），磷酸（分析純，購于江蘇永華化學(xué)科技有限公司，批號：20141102）。發(fā)酵的麥芽粗纖維購于蕭山啤酒廠，采用過濾槽法將麥汁（溶于水的浸出物）和麥糟（殘留的皮殼、高分子蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪等）分離；然后采用間接式加熱干燥法烘干后壓扁破碎，篩去皮殼，留取其中細粉部分，消毒干燥成型即得麥芽纖維，麥芽纖維純度測定參考相關(guān)文獻[9]。山藥、茯苓、三七、白及4味中藥的4個批次藥物分別購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)門診部、浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館、浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院名中醫(yī)館和胡慶余堂。標準對照品三七皂苷R1（批號：110703-201631）、人參皂苷Rb1（批號：110704-201625）、薯蕷皂苷（批號：111707-201402）、茯苓酸（批號：1110705201603）均購于中國藥品生物制品檢定所，Coelonin購于美國Sigma公司（批號：SMB00095）。

2 方法

2.1 色譜條件和色譜柱 采用phenomenex-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相采用乙腈和 0.1%磷酸水梯度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長為203nm，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Scratch elution program

2.2 溶液制備

2.2.1 標準對照品溶液的制備 精密稱取標準對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸各1.00mg，分別置于5mL容量瓶中，加一定量甲醇，搖勻，超聲使其完全溶解，放至室溫后加甲醇定容，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸標準對照品單體溶液，濃度均為0.20mg·mL-1。再精密稱取標準對照品三七皂苷R1 3.25mg、人參皂苷 Rb1 2.10mg、Coelonin 0.40mg、薯蕷皂苷1.85mg、茯苓酸0.80mg，置于同一個5mL容量瓶，盡量使5種成分的比例與樣品中保持一致，然后加入一定量甲醇（分析純），搖勻，超聲使其完全溶解，放至室溫后加甲醇定容，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸標準對照品混合溶液，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸濃度分別為 0.65mg·mL-1、0.42mg·mL-1、0.08mg·mL-1、0.37mg·mL-1、0.16mg·mL-1。將上述兩種溶液用 0.45μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。

2.2.2 樣品溶液的制備 麥芽纖維、山藥、茯苓、三七、白及粉末按 3：2：2：1：1 比例混合后，用超微粉碎機粉碎并混合均勻，得到新麥纖散粉劑。精密稱取新麥纖散粉末3.00g，置于100mL錐形瓶中，加入甲醇60mL，超聲1h后室溫放置15min，取上清液，濾渣加30mL甲醇，超聲30minF口取上清液，合并兩次上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收，最終定容為5mL，用0.45μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 新麥纖散中薯蕷皂苷、茯苓酸、三七皂苷R1與人參皂苷Rb1、Coelonin分別來自中藥山藥、茯苓、三七、白及，根據(jù)新麥纖散處方組成比例，按照2.2.2樣品溶液的制備方法，分別配置缺山藥、缺茯苓、缺三七和缺白及的陰性樣品溶液，備用。

2.3 專屬性實驗 分別取標準對照品混合溶液、樣品溶液及各陰性樣品溶液，按2.1項色譜條件分別進行進樣分析，進樣量為10μL，記錄色譜圖。

2.4 標準曲線及線性關(guān)系考察 取標準對照品混合溶液適量，甲醇稀釋定容，得到一系列質(zhì)量濃度的標準對照品混合溶液，按2.1項色譜條件進樣，進樣量為10μL，記錄色譜圖。

2.5 精密度實驗 分別取同一標準對照品混合溶液，按2.1項色譜條件連續(xù)自動進樣8次，進樣量為10μL，記錄色譜峰面積。

2.6 重復(fù)性實驗 分別精確稱取新麥纖散8份，每份3.00g，按2.2.2項制備方法平行制備樣品溶液8份，按2.1項色譜條件分別進樣，進樣量為10μL，記錄色譜峰面積，計算各成分含量。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取制備好的同一樣品溶液，室溫放置，按2.1項色譜條件每2h進樣一次，進樣量為10μL，記錄三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的色譜峰面積。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的新麥纖散6份，每份1.50g，置于錐形瓶中，分別加入濃度為0.20mg·mL-1的三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸標準對照品單體溶液4.00mL、11.50mL、0.30mL、1.90mL、0.86mL，按 2.2.2項制備方法制備成6份溶液備用，按2.1項色譜條件分別進樣，進樣量為10μL，記錄各色譜峰面積，計算各成分含量。樣品回收率（%）＝（測得量－樣品含量）/加樣量×100%。

2.9 樣品含量測定 分別精密稱取4個不同購買批次的新麥纖散每批各3份，每份3.00g，按2.2.2項制備方法制備樣品溶液，按2.1項色譜條件分別進樣，進樣量為10μL，并記錄三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的峰面積，計算各成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實驗 結(jié)果顯示樣品溶液色譜圖中出現(xiàn)與標準對照品混合溶液色譜圖中保留時間相一致的特征峰，分別為三七皂苷 R1、人參皂苷 Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸，而陰性樣品無此特征峰，表明其他組分對所測組分無干擾。該項實驗證實本方法專屬性良好。見圖1、2。

圖1 標準對照品混合和新麥纖散樣品RP-HPLC結(jié)果Fig.1 RP-HPLC of mixing standard substance and new Maixiansan sample

圖2 陰性樣品RP-HPLC圖Fig.2 RP-HPLC of negative sample

3.2 標準曲線與線性關(guān)系考察 分別以質(zhì)量濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y繪制標準曲線，得回歸方程，結(jié)果見表2。該項實驗證實三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的線性關(guān)系良好。

表2 標準曲線與線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.2 Results of standard curve and linear relationship

3.3 精密度實驗 計算得三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為 1.12%、1.03%、0.98%、0.74%和0.77%。該項實驗證實儀器精密度良好，RSD均不大于2%[9]。

3.4 重復(fù)性實驗 8次重復(fù)測定新麥纖散5種成分含量，結(jié)果見表3。該項實驗證實該方法重復(fù)性良好（RSD不大于2%）[9]。

3.5 穩(wěn)定性實驗 結(jié)果顯示三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的峰面積RSD分別為：0.8662%、0.3481%、0.4402%、0.7065%、0.4756%。該項實驗證實新麥纖散樣品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定（RSD不大于2%）[9]。

3.6 加樣回收率實驗 三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸的平均加樣回收率結(jié)果見表4。各成分回收率RSD值分別為1.27%、0.54%、0.53%、1.48%和0.81%，結(jié)果表明該方法準確度良好（RSD不大于2%）[9]。

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果（n=8）Tab.3 Results of repetitive test(n=8)

4 討論

麥纖散是一種可以更好保護腸黏膜屏障，更有效改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和腸道微環(huán)境的中藥復(fù)方制劑[1]，新麥纖散則在此基礎(chǔ)上新增三七、白及，可更有效地

表4 三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷、茯苓酸的平均加樣回收率（n=6）Tab.4 Sample recovery results of panax notoginseng saponins R1,ginsenoside Rb1,Coelonin,diosgenin and poria acid(n=6)

3.7 樣品含量的測定 結(jié)果顯示麥芽纖維與不同批次的山藥、茯苓、三七、白及組成的新麥纖散中三七針對潰瘍性結(jié)腸炎脾虛為本，瘀毒為標的中醫(yī)病機。方中麥芽纖維可有效調(diào)整腸道免疫反應(yīng)，增強腸道黏膜屏障功能，使黏膜的炎癥得以緩解[10]。三七具有免疫調(diào)節(jié)與抗炎活性，可對炎性反應(yīng)發(fā)生的多個環(huán)節(jié)，多種炎性介質(zhì)產(chǎn)生影響[11]。此外，三七皂苷能升高炎性細胞內(nèi)游離鈣的水平，降低磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）的活性，且能夠有效地釋放地諾前列酮從而達到抗炎作用[12]。李季委等[13]研究了薯蕷皂苷對潰瘍性結(jié)腸炎的作用，結(jié)果表明薯蕷皂苷能夠治療老年慢性潰瘍性結(jié)腸炎，具有一定的抗炎作用。黃斯等[14]發(fā)現(xiàn)茯苓酸對皮膚、口腔、耳道等局部炎癥有顯著抗炎作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明白及有止血、抗炎、抗腫瘤、促進創(chuàng)傷愈合及細胞生長等作用[15]。全方五種藥物相互配伍，達到健脾固腸，止血愈瘍之效。

表5 不同批次新麥纖散含量測定結(jié)果Tab.5 Results of four different batches of new Maixiansan content determination

雖然有文獻報道用高效液相色譜法分別測定三七中三七皂苷R1與人參皂苷Rb1[5]、白及中Coelonin[6]、山藥中薯蕷皂苷[7]和茯苓中茯苓酸的含量[8]，但由于提取條件及液相條件的限制，只能研究一種中藥中單一或少數(shù)成分，尚不能同時分析以上5種成分。目前文獻中關(guān)于麥芽纖維有效成分的液相色譜研究報道較少，而且缺少標準對照品，故本研究未做測定分析。筆者在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，提取條件中提取溶劑、提取方法和提取時間對新麥纖散中三七皂苷R1、皂苷R1、人參皂苷Rb1、Coelonin、薯蕷皂苷和茯苓酸的含量很接近，結(jié)果見表5。人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、茯苓酸和Coelonin的含量測定有一定的影響。在選擇提取溶劑時，筆者曾采用甲醇、甲醇-水（9:1）、甲醇-水（5:5）、乙醇、乙醇-水（9:1）、乙醇-水（5:5）幾種不同的溶劑組合，結(jié)果顯示甲醇提取效果最好，提取有效成分更多，且操作簡便。在實驗過程中筆者還發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為提取溶劑并經(jīng)過超聲處理能夠進一步提高提取效率，而甲醇的體積、超聲處理時間及提取次數(shù)對提取效果也有一定的影響，先加60mL甲醇超聲處理1h后過濾，濾渣再加30mL甲醇再次超聲處理1h能夠提取大量有效成分，這樣提取效率最高。因此筆者最終以甲醇為提取溶劑，超聲處理2次，每次1h，用于新麥纖散樣品的提取。

由于新麥纖散制劑中的藥物性味較多，其有效成分中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷屬于皂苷類化合物，茯苓酸屬于三萜類化合物、Coelonin則屬于菲類化合物，各成分之間存在一定的干擾，采用單一化合物的流動相體系無法滿足5種待測成分同時分離測定的要求。在前期實驗過程中，筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動相體系，結(jié)果表明單一流動相各物質(zhì)分離效果不太理想，待測成分之間或待測成分與雜質(zhì)成分之間不能良好分離甚至無法分離。當流動相中的有機相為甲醇時，會出現(xiàn)基線不穩(wěn)、漂移等情況。經(jīng)過多次實驗發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，梯度洗脫三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、茯苓酸和Coelonin的分離效果較好。

本研究建立的RP-HPLC法可同時測定新麥纖散中5種有效成分的含量，通過對4個批次藥物中5種有效成分含量的測定，發(fā)現(xiàn)不同批次的藥材中以上成分含量相差不大，并可較全面的反映市面上組成新麥纖散的藥材中成分的含量。本實驗建立的方法與單獨測定某種成分含量的方法相比更簡便、快捷；且靈敏度高、選擇性好、能同時分析多種成分，可作為新麥纖散質(zhì)量評價方法之一，為新麥纖散質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)，并為今后新麥纖散藥效學(xué)及藥代動力學(xué)研究打下一定基礎(chǔ)，具有較重要的意義。

[1]水楠楠,徐方麗,李麗樂,等.麥纖散促潰瘍性結(jié)腸炎大鼠受損腸黏膜屏障修復(fù)機制初探[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,40(12):876-882.

SHUI Nannan,XU Fangli,LI Lile,et al.The mechanism ofmaixiansan on protecting intestinalmucosalbarrier damage in UC rats[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2016,40(12):876-882.

[2]陳艷.山藥的藥理作用與產(chǎn)品開發(fā)[J].食品與發(fā)酵科技,2015,51(1):60-62+69.

CHEN Yan. Pharmacological effects and product development of yam[J].Food and Fermentation Technology,2015,51(1):60-62+69.

[3]林虓,何艷梅.茯苓三萜化合物的藥理作用研究進展[J].黑龍江科技信息,2014,(31):77.

LIN Xiao,HE Yanmei.Research progress on pharmacological action of poria triterpenoid compounds[J].Heilongjiang Science and Technology Information,2014,(31):77.

[4]辛衛(wèi)云,白明,苗明三,等.麥芽的現(xiàn)代研究[J].中醫(yī)學(xué)報,2017,32(4):613-615.

XIN Weiyun,BAI Ming,MIAO Mingsan,et al.Modern research of malt[J].Journal of Traditional Chinese Medicine,2017,32(4):613-615.

[5]武雙,郭從亮,崔秀明,等.HPLC法同時測定生三七和蒸制三七中10種皂苷類成分的含量[J].中藥材,2015,38(8):1622-1625.

WU Shuang,GUO Congliang,CUIXiuming,etal.Simultaneous determination of 10 kinds of saponins in sanqi and sanqi in soya decoction by HPLC[J].Chinese Herbal Medicine,2015,38(8):1622-1625.

[6]張曉靜,趙艷霞,鄧雁如,等.HPLC同時測定白及中3種成分的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(21):40-42.

ZHANG Xiaojing,ZHAO Yanxia,DENG Yanru,et al.HPLC Simultaneous determination of 3 components in Bletillae[J].Chinese Journal of Experimental Chinese Medicine,2015,21(21):40-42.

[7] 王瑩,陳雪珊,施洋,等.RP-HPLC法測定山藥中薯蕷皂苷的含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2017,40(4):516-517+522.

WANG Ying,CHEN Xueshan,SHIYang,etal.Determination ofdiosgenin in RhizomaDioscoreae by RP-HPLC[J].Journal of Xinjiang Medical University,2017,40(4):516-517+522.

[8]周軍,史德勝,王杰,等.HPLC法測定茯苓配方顆粒中茯苓酸的含量[J].天津藥學(xué),2015,27(6):16-17.

ZHOU Jun,SHI Desheng,WANG Jie,et al.Determination of content of pachymic acid in poria formula granule by HPLC[J].Tianjin Pharmaceutical,2015,27(6):16-17.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

State Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People's Republic of China[M].Beijing:China Medical Science and Technology Press,2015.

[10]劉永濤,胡正芬,鄭紅斌,等.麥芽纖維對UC小鼠腸道菌群的影響[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,18(8):471-472.

LIU Yongtao,HU Zhengfen,ZHENG Hongbin,etal.Effectoffiber extracted from germinated barley on intestinal microflora of rats with UC[J].Zhejiang Journal of Integrated Traditional China,2008,18(8):471-472.

[11]黃家林,田代雄.三七總皂苷抗炎免疫藥理研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(11):4657-4660.

HUANG Jialin,TIAN Daixiong.Research progress on the anti-inflammatory-immunity effect of the panax notoginseng saponins[J].China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,2016,31(11):4657-4660.

[12]段寅慧,吳敏.三七總皂苷藥理研究及臨床應(yīng)用進展[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(2):108-110.

DUAN Yinhui,WU Min.PNS progress in pharmacological research and clinical application[J].Information on Traditional Chinese Medicine,2014,31(2):108-110.

[13]李季委,謝晶日,李鐵男,等.薯蕷皂苷片治療老年慢性潰瘍性結(jié)腸炎臨床實驗研究[J].中國初級衛(wèi)生保健,2009,23(9):72.

LI Jiwei,XIE Jingri,LI Tienan,et al.Clinical study of diosgenin tablets in the treatment of chronic ulcerative colitis in elderly[J].Chin Prim Health Care,2009,23(9):72.

[14]黃斯,潘雨薇,藍海,等.茯苓酸藥理學(xué)研究進展[J].中成藥,2015,37(12):2719-2721.

HUANG Si,PAN Yuwei,LAN Hai,et al.Advances in pharmacology of Poria thread[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2015,37(12):2719-2721.

[15]湯逸飛,阮川芬,應(yīng)晨,等.白及屬植物化學(xué)成分與藥理作用研究進展[J].中草藥,2014,45(19):2864-2872.

TANG Yifei,RUAN Chuanfen,YING Chen,et al.Research progress on chemical constituents and medical functions in plants of Bletilla Rchb.f.[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2014,45(19):2864-2872.