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骨組織脫鈣方法探討*

2018-02-12 13:28方捷迪王曉星李爭(zhēng)艷易慕華
關(guān)鍵詞:骨組織甲酸硝酸

方捷迪,王曉星,李爭(zhēng)艷,周 琴,易慕華

(三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院病理科,湖北宜昌 443001)

骨組織是由黏多糖和一些蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成的骨樣組織和沉著于其中的無(wú)機(jī)鹽形成的,是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織,包括細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞隨其發(fā)育階段可分為骨祖細(xì)胞、骨母細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞[1],細(xì)胞外基質(zhì)包括有機(jī)物和無(wú)機(jī)物,有機(jī)物中包括膠原纖維和無(wú)定形基質(zhì),無(wú)機(jī)物中主要為骨鹽。脫鈣是應(yīng)用化學(xué)或物理化學(xué)的方法將骨組織成分中的鈣鹽與膠原纖維分離,棄去鈣鹽[2],保留完整有機(jī)成分的一種方法。脫鈣方法與脫鈣液的選擇與骨組織切片的制作質(zhì)量有著密切的關(guān)系。骨組織在制片前必須用脫鈣液將組織中的鈣鹽除去,才能制成4~5 μm厚的切片[3]。如果脫鈣不完全,切片時(shí)不僅損壞刀刃,而且染色時(shí)組織易出現(xiàn)脫片等現(xiàn)象[4]。如果脫鈣過(guò)度,會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu),使組織抗原丟失,嚴(yán)重影響對(duì)送檢標(biāo)本的臨床病理診斷[5],因此選擇合適的脫鈣方法很有必要。脫鈣液有無(wú)機(jī)酸(硝酸、鹽酸、硫酸)和有機(jī)酸(醋酸、甲酸)兩大類(lèi)[6],脫鈣液是決定骨骼組織切片質(zhì)量、染色效果的關(guān)鍵[7]。目前在臨床病理脫鈣中,有3種脫鈣液較理想,本研究通過(guò)比較3種脫鈣液的脫鈣效果和染色制片質(zhì)量,旨在選擇一種最好的脫鈣方法應(yīng)用于臨床骨組織脫鈣。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院送檢的骨腫瘤、病變骨及鈣化組織標(biāo)本15例,組織離體后即用10%中性緩沖甲醛溶液充分固定12~24 h。

1.2試劑及儀器 濃鹽酸、硝酸、無(wú)水乙醇購(gòu)自廣東汕頭西隴化工股份有限公司;甲酸、氯仿、蘇木素、伊紅、中性樹(shù)膠購(gòu)自珠海Baso公司;冰醋酸、二甲苯、甲醛購(gòu)自武漢市中天化工有限公司。常州中威TSJ-QX型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī),WB-3000型包埋機(jī),徠卡2235型切片機(jī)。

1.3試劑配制 (1)改良Jenkins混合溶液:濃鹽酸5 mL,冰醋酸5 mL,氯仿10 mL,無(wú)水乙醇70 mL,10%中性緩沖甲醛10 mL。(2)硝酸-甲醛液:甲醛10 mL,蒸餾水90 mL,純硝酸20 mL。(3)甲酸-甲醛液:甲酸15 mL,甲醛5 mL,蒸餾水80 mL。(4)10%中性緩沖甲醛液的配制:蒸餾水1 000 mL,37%的甲醛溶液100 mL,磷酸二氫鈉4 g,磷酸氫二鈉6.5 g,用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7.2~7.4。

1.4方法 (1)固定。組織要求及時(shí)充分固定,大塊骨組織應(yīng)鋸開(kāi)固定,用中性緩沖甲醛液固定時(shí)間不少于12~24 h。(2)取材。骨髓穿刺標(biāo)本一般長(zhǎng)約1 cm、直徑0.05~0.1 cm,不需修塊,可直接用濾紙包好脫鈣。大塊的骨腫瘤、病變骨、鈣化組織根據(jù)標(biāo)本的不同用骨鉗或骨鋸處理成1.5 cm×1.0 cm×0.2 cm的骨組織塊。(3)脫鈣及終點(diǎn)判斷。①物理方法:隨時(shí)觀察脫鈣情況,當(dāng)組織塊呈半透明狀浮在液面上,手指按壓柔軟有彈性,用大頭針可輕松刺入骨皮質(zhì)表示脫鈣完全。②化學(xué)方法:用吸管取脫鈣液1 mL,加10%草酸鉀1 mL搖勻,以草酸鹽結(jié)晶不析出為脫鈣終點(diǎn)。(4)脫鈣后的除酸處理。脫鈣完全后,標(biāo)本用流水沖洗5 min,碳酸鋰飽和水溶液5 min,沖洗3次;再流水沖洗10 min,即可進(jìn)行常規(guī)脫水,染色時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)組織在蘇木素中的時(shí)間,而在伊紅停留的時(shí)間適當(dāng)縮短,這樣可以得到更好的對(duì)比度。

1.5觀察指標(biāo) 骨組織脫鈣時(shí)間、骨組織、HE染色效果。

2 結(jié) 果

經(jīng)上述方法比較得出:骨組織塊經(jīng)改良Jenkins液常溫脫鈣4 d左右脫鈣完全,組織損傷小,常規(guī)制片效果好,切片平坦,薄厚均勻,鏡下見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)完整,無(wú)皺縮、龜裂現(xiàn)象,細(xì)胞核呈藍(lán)色,骨基質(zhì)、纖維、軟骨呈不同程度的紅色,色澤鮮艷,對(duì)比度好。骨組織塊在甲酸-甲醛脫鈣液中72~120 h脫鈣完全,組織損傷較小,切片結(jié)構(gòu)完整,染色鮮艷均勻,對(duì)比度較好。骨組織塊在硝酸-甲醛脫鈣液中48~60 h到達(dá)脫鈣終點(diǎn),肉眼見(jiàn)組織稍發(fā)泡腫脹,顏色淡黃,切片容易出現(xiàn)刀痕;鏡下見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)欠完整,胞核淡染著色弱,對(duì)比度欠佳。3種脫鈣液脫鈣時(shí)間的比較,甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>硝酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液脫鈣效果的比較,硝酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液。3種脫鈣液對(duì)組織損傷的比較,硝酸-甲醛脫鈣液>甲酸-甲醛脫鈣液>改良Jenkins脫鈣液。

3 討 論

脫鈣是骨組織制片中的必要環(huán)節(jié),如若脫鈣不徹底,則組織切片困難,染色時(shí)易脫片,鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)模糊,胞核皺縮,部分區(qū)域折疊卷曲,影響病理診斷的及時(shí)性和準(zhǔn)確性[8]。尋找簡(jiǎn)便、快捷、有效的脫鈣方法是骨組織病理學(xué)研究的重要課題之一。結(jié)合多年骨組織脫鈣經(jīng)驗(yàn),筆者認(rèn)為以下方面值得關(guān)注。

3.1骨組織的固定 骨組織及時(shí)、充分的固定不僅能保存良好的骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu),而且能防止組織自溶腐敗,阻止細(xì)胞內(nèi)外的酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用、保存組織細(xì)胞的抗原性[9]。脫鈣液中的酸對(duì)骨組織有不同程度的損傷,未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織大3倍,所以骨組織必須先固定后脫鈣,或脫鈣與固定同時(shí)進(jìn)行,未經(jīng)固定的骨組織不宜脫鈣。

3.2脫鈣時(shí)應(yīng)權(quán)衡的因素 (1)盡量減少脫鈣液對(duì)組織和細(xì)胞成分的損傷,保護(hù)組織微細(xì)結(jié)構(gòu)。(2)能充分去除鈣質(zhì),又不影響后續(xù)HE和IHC染色。(3)脫鈣方法簡(jiǎn)單,試劑價(jià)廉易得,適當(dāng)兼顧脫鈣時(shí)間[10]。

3.3脫鈣后的中和酸處理 常規(guī)硝酸脫鈣后的組織一般需要流水沖洗10~12 h,費(fèi)時(shí)又不環(huán)保,本文脫鈣到達(dá)終點(diǎn)后先流水沖洗5 min,然后飽和碳酸鋰水溶液處理5 min×3次,再流水沖洗10 min,只需短短30 min即完成整個(gè)除酸過(guò)程。具有以下優(yōu)點(diǎn):由于飽和碳酸鋰水溶液是一種弱堿液,能很快滲入到組織細(xì)胞中中和酸,大大縮短了流水洗滌時(shí)間,經(jīng)此改進(jìn)除酸方法制成的切片對(duì)蘇木素嗜染性強(qiáng),效果穩(wěn)定。

3.4脫鈣液的選擇 本科室近年來(lái)一直采用10%硝酸脫鈣,主要是因?yàn)槠涿撯}能力強(qiáng),脫鈣時(shí)間短,但這也使骨組織的脫鈣程度較難掌握,容易過(guò)脫,對(duì)組織造成損傷。硝酸在脫鈣過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生二氧化碳,氣泡從組織中溢出會(huì)使結(jié)締組織分離[11],破壞組織結(jié)構(gòu)。另外,硝酸處理組織后染色效果差,胞核不著色或著色淺,不均勻,對(duì)比度欠佳。甲酸又名蟻酸,其脫鈣速度比硝酸慢,破壞組織的程度比硝酸輕,但脫鈣時(shí)間稍長(zhǎng),疏松骨片需脫鈣48 h,致密骨片需4~5 d,其中每3 d需更換新液1次[1]。所以迫切需要尋找好的脫鈣方法取而代之。通過(guò)查閱文獻(xiàn),綜合比較文獻(xiàn)介紹的較為理想的3種脫鈣方法,發(fā)現(xiàn)Jenkins復(fù)合脫鈣液棄硝酸而選用鹽酸,對(duì)組織損傷小,不會(huì)使組織膨脹,而是使組織略有收縮。骨組織塊經(jīng)此液脫鈣后,切片完整,平坦均勻,無(wú)返砂現(xiàn)象。不足之處同樣在于組織處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng),脫鈣完全約需要7 d左右。2015年初本科室摸索改良Jenkins原配方,爭(zhēng)取縮短脫鈣時(shí)間,實(shí)驗(yàn)中把鹽酸的量由原來(lái)的4 mL增加為5 mL,冰醋酸由原來(lái)的3 mL也增加為5 mL,無(wú)水乙醇由原來(lái)的73 mL降為70 mL,氯仿及甲醛劑量不變,經(jīng)過(guò)近50例骨組織塊脫鈣觀察,組織處理時(shí)間大為縮短,骨密度高的如股骨組織塊常溫下72 h即可徹底脫鈣,骨密度較低的骨松質(zhì)36~48 h也能脫鈣完全,若加急則可以將脫鈣液放入37 ℃恒溫箱中,骨組織塊24 h左右即達(dá)到脫鈣要求。此組合脫鈣液中鹽酸為強(qiáng)酸,增加鹽酸用量旨在加快脫鈣時(shí)間,同時(shí)又擔(dān)心影響細(xì)胞核的著色,實(shí)際操作中觀察發(fā)現(xiàn),通過(guò)改善除酸方式,鹽酸與生理鹽水和氯仿混合后對(duì)細(xì)胞核的著色影響甚微,鹽酸除了加快脫鈣速度,還有使組織略收縮的功效,降低了冰醋酸對(duì)組織膨脹的影響[12]。由于骨組織的致密性,固定劑的選用要求具有強(qiáng)的穿透力,Jenkins復(fù)合脫鈣液選用中性甲醛,甲醛具有穿透速度快、固定均勻、對(duì)組織收縮較小的特點(diǎn),使得脫鈣液不但具有脫鈣作用,同時(shí)兼具較好的固定作用。冰醋酸具有在固定時(shí)穿透速度快,且有防止組織自溶變性的特點(diǎn),同時(shí)還能使組織略膨脹,稍加量即可抵消鹽酸及甲醛引起的組織收縮和硬化[13]。骨組織在改良Jenkins液脫鈣徹底后切片光滑細(xì)膩,厚度可達(dá)4 mm,骨與骨周?chē)M織形態(tài)保持完整,骨髓腔內(nèi)的細(xì)胞清晰可見(jiàn),胞質(zhì)、胞核及骨小梁著色均勻,色彩鮮艷,對(duì)比度強(qiáng),能較好地顯示骨組織的各種結(jié)構(gòu),是一種較理想的用于臨床病理工作的脫鈣方法。

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