張 力，茆 軍，張 立，黃正泉，梅 偉，丁 亮，王培民

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)， 江蘇 南京 210023 ；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨傷科，江蘇 南京 210029)

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種依賴半胱氨酸天冬氨酸(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族蛋白酶活性的細(xì)胞程序性死亡形式。最初對焦亡的研究聚焦于機(jī)體的免疫防御，這種特殊的細(xì)胞死亡方式能有效破壞病原菌的生存環(huán)境并控制感染；近年來的研究則更多的關(guān)注到焦亡在清除內(nèi)源性危險(xiǎn)信號傳導(dǎo)過程中扮演的角色。此外，細(xì)胞焦亡及其釋放的炎性因子與肺、肝、腎等組織的纖維化密切相關(guān)，參與形成“焦亡-炎性反應(yīng)-纖維化”軸樣病理改變。本課題組關(guān)注細(xì)胞焦亡在膝骨關(guān)節(jié)炎中的作用，率先揭示了膝骨關(guān)節(jié)炎的滑膜成纖維細(xì)胞存在NLRP1、NLRP3炎性小體的激活，并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，促進(jìn)下游炎性反應(yīng)，對膝骨關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展存在推動作用[1]。然而，焦亡在膝骨關(guān)節(jié)炎中的具體激活機(jī)制及其與滑膜纖維化的聯(lián)系仍在緊張的探索中。

1 細(xì)胞焦亡的特征與激活

1.1 細(xì)胞焦亡的特征

細(xì)胞焦亡主要發(fā)生在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等骨髓系吞噬細(xì)胞，此外，在CD4+T細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了焦亡的證據(jù)。焦亡的發(fā)生，首先會在細(xì)胞膜上形成1.1～2.4 nm的孔洞，進(jìn)而導(dǎo)致跨膜離子通量異常和細(xì)胞腫脹，最終，細(xì)胞膜破裂并伴隨著促炎因子IL-1β、IL-18的釋放而發(fā)生滲透溶解。這一形態(tài)變化與細(xì)胞壞死具有相似之處，同時(shí)焦亡也表現(xiàn)出細(xì)胞核濃縮和染色質(zhì)DNA 斷裂等細(xì)胞凋亡的生化特點(diǎn)。

細(xì)胞焦亡區(qū)別于其他細(xì)胞死亡方式的重要特征主要包括3個(gè)方面：1)焦亡依賴于caspase-1 或caspase-4/5/11，它們分別通過經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑啟動焦亡過程。2)細(xì)胞膜形成孔洞。3)促炎因子IL-1β、IL-18的釋放及其誘發(fā)的炎性級聯(lián)放大反應(yīng)。

1.2 炎性小體的激活

炎性小體被定義為一種細(xì)胞內(nèi)多聚蛋白復(fù)合物，由模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)、適配器蛋(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和效應(yīng)酶(caspase)組裝而成，通過分泌細(xì)胞因子、介導(dǎo)細(xì)胞死亡等細(xì)胞反應(yīng)抵御即時(shí)危險(xiǎn)。

經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡以NLPR3炎性小體的研究最為徹底。當(dāng)細(xì)胞上的PRRs受到信號刺激時(shí)，NF-κB信號通路將介導(dǎo)NLRP3蛋白和IL-1β、IL-18前體的上調(diào)。隨后，積聚的NLRP3蛋白，ASC和caspase-1前體形成具有活性的NLRP3炎性小體，水解 pro-caspase-1為活性形式caspase-1。激活的caspase-1進(jìn)一步發(fā)揮其切割I(lǐng)L-1β、IL-18和活化gasdermin-D(GSDMD)的作用，驅(qū)動IL-1β和IL-18的成熟分泌及焦亡。

在非經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡中，革蘭陰性菌的LPS直接或通過TLR 4激活caspase-11(人caspase-4和caspase-5)，隨后剪切GSDMD來介導(dǎo)焦亡，該途徑中，IL-1β、IL-18前體的成熟分泌仍然依賴經(jīng)典途徑中caspase家族和相應(yīng)炎性小體的激活。

除此之外，當(dāng)caspase-1或GSDMD被抑制時(shí)，caspase-8能夠與NLRC4相互作用，隨后被招募到Naip5/NLRC/ASC炎性小體中，該過程依賴ASC，但獨(dú)立于caspase-1和caspase-11，活化的caspase-8進(jìn)一步介導(dǎo)IL-1β、IL-18的成熟并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[2]。

1.3 Gasdermin D的介導(dǎo)

GSDMD是gasdermin蛋白家族的一員，是人類和鼠科動物細(xì)胞焦亡的重要介質(zhì)。CRISPR-Cas9 技術(shù)證實(shí)，GSDMD對經(jīng)典和非經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡而言，都是必須的?；罨?caspase-1/4/5/11可對GSDMD進(jìn)行特異性切割，這種切割是驅(qū)動焦亡的充分必要條件。此外，GSDMD控制IL-1β的釋放，但不控制成熟[3]。

被切割后的GSDMD將其N-末端結(jié)構(gòu)域插入細(xì)胞膜，并組裝大量的寡聚復(fù)合體組裝跨膜孔來靶向、插入和滲透細(xì)胞膜[4]。因此，GSDMD是一種新型的造孔蛋白并與細(xì)胞焦亡時(shí)細(xì)胞膜表明的空隙形成有關(guān)，然而，其中涉及的具體機(jī)制尚不明確。

2 細(xì)胞焦亡與組織纖維化

纖維化是組織慢性纖維增生性的過程，以效應(yīng)細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(包括膠原纖維)的沉積為主要特征，最終導(dǎo)致組織瘢痕形成。常見纖維化組織包括肝、肺、腎和滑膜，其共同特點(diǎn)是慢性炎性反應(yīng)的浸潤，免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和其他常駐細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)。近來，對細(xì)胞焦亡的研究中發(fā)現(xiàn)了“焦亡-炎性反應(yīng)-纖維化”這樣的軸樣病理改變，參與了多種組織的纖維化過程，推動病程進(jìn)展。

2.1 肝纖維化

細(xì)胞死亡和炎性反應(yīng)是肝纖維化發(fā)展的兩大核心因素。炎性小體存在于肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞內(nèi)，是調(diào)控炎性反應(yīng)和細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵。它們通過激活caspase-1，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，并釋放促炎因子IL-1β和IL-18啟動炎性級聯(lián)放大，這一過程可以推動纖維化的進(jìn)展，其主要的細(xì)胞靶點(diǎn)是肝星狀細(xì)胞的激活。在慢性炎性肝病中，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞往往作為活化肝星狀細(xì)胞的上游而受到廣泛的研究。

在NLRP3基因過表達(dá)的小鼠中，NLRP3炎性小體的持續(xù)激活會導(dǎo)致小鼠存活時(shí)間縮短，生長不良，中性粒細(xì)胞浸潤和肝臟星狀細(xì)胞活化，肝臟炎性反應(yīng)嚴(yán)重，肝內(nèi)膠原沉積，肝臟纖維化明顯，同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)分析非實(shí)質(zhì)中分離出肝細(xì)胞活性caspase-1-碘化丙酸丙酯(PI)陽性細(xì)胞[5]，證實(shí)了肝細(xì)胞焦亡的存在，進(jìn)而將“肝細(xì)胞焦亡-肝臟炎性反應(yīng)-肝纖維化”聯(lián)系了起來。體外實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞外ATP可以通過P2X7受體激活肝星狀細(xì)胞NLRP3炎性小體，并促進(jìn)α-SMA 和Ⅰ型膠原等纖維化標(biāo)志物的釋放而導(dǎo)致肝纖維化[6]，然而，肝星狀細(xì)胞是否進(jìn)一步發(fā)生焦亡卻未在研究之列。抑制caspase-1和IL-1β的小鼠則表現(xiàn)出肝臟纖維化程度的減輕。眾所周知，IL-1β是肝纖維化過程的重要媒介，可促進(jìn)肝臟星狀細(xì)胞的增殖和分化，上調(diào)成纖維標(biāo)志物水平，包括金屬蛋白酶、組織金屬蛋白酶抑制劑-1、膠原-1α1和轉(zhuǎn)化生長因子-β等。

越來越多的證據(jù)支持軸樣病理改變在肝纖維化發(fā)展中的中心作用。在肝kupffer細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)性纖維化模型中，發(fā)現(xiàn)了包括NLRP1、NLRP3和AIM 2炎性小體的顯著高表達(dá)[7-8]；在非酒精性脂肪肝炎的小鼠模型中，纖維化改變依賴NLRP3的激活，這表明靶向這種復(fù)合物可能是阻止或逆轉(zhuǎn)非酒精性脂肪肝炎中肝臟纖維化發(fā)展的有效手段[9]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞包含microRNA-233的外泌體能緩解LPS/ATP所致肝細(xì)胞損傷，下調(diào)NLRP3、caspase-1及多種纖維化相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[10]。這些發(fā)現(xiàn)，為“焦亡-炎性反應(yīng)-纖維化”的干預(yù)治療提供了新的思路。

2.2 肺纖維化

肺纖維化涉及炎性反應(yīng)和間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致間質(zhì)組織和基底膜細(xì)胞外基質(zhì)的聚集，肺泡結(jié)構(gòu)的破壞。肺上皮細(xì)胞通常被認(rèn)為是肺纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。

NLRP3-/-的肺泡上皮細(xì)胞中，炎性反應(yīng)減弱，纖維化標(biāo)志物的水平也相應(yīng)降低[11]。同樣，在基因缺乏ASC或caspase-1或用caspase-1抑制劑處理的纖維化模型小鼠中，肺中性粒細(xì)胞的浸潤出現(xiàn)減弱[12]。在高氧狀態(tài)下，NLRP3-/-小鼠表現(xiàn)出較低的肺部炎性反應(yīng)，包括炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子表達(dá)[13]。這些發(fā)現(xiàn)為肺纖維化中的細(xì)胞焦亡與炎性反應(yīng)構(gòu)建聯(lián)系。

博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，NLRP3、caspase-1、ASC均存在高表達(dá)，下游IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α相應(yīng)上調(diào)，促炎因子進(jìn)一步通過TGF-β1-磷酸化SMAD和ERK1/2上調(diào)膠原Ⅰ/Ⅲ、纖連蛋白及α-SMA參與肺纖維化[14]。在LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型中，肺組織NLRP3和ASC出現(xiàn)高表達(dá)，下游IL-1β、IL-18和TGF-β1的升高則介導(dǎo)了肺纖維化改變。在巨噬細(xì)胞株上進(jìn)行的離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS/ATP能誘導(dǎo)的細(xì)胞活性氧ROS的生成，活化caspase-1，隨后引起與上述動物模型相似的纖維化反應(yīng)[15]。這些研究雖然對NLRP3炎性小體及下游促炎因子的表達(dá)水平做出了定量分析，但缺少對細(xì)胞焦亡的直接觀察。盡管如此，炎性小體的激活與炎性反應(yīng)、纖維化密切相關(guān)，這一點(diǎn)仍然可以作為研究“焦亡-炎性反應(yīng)-纖維化”軸在肺系病變的依據(jù)。

2.3 腎纖維化

在慢性腎病中經(jīng)典和非經(jīng)典途徑都可以激活NLRP3炎性小體，并參與隨后的多種病理變化，例如腎小球腎炎或是腎小管間質(zhì)的損傷。

腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，NLRP3會通過非經(jīng)典途徑激活并介導(dǎo)間質(zhì)纖維化，奇怪的是，該研究并未發(fā)現(xiàn)IL-1β的差異。另有研究關(guān)注NLRP3對腎小管上皮細(xì)胞TGF-β信號的調(diào)節(jié)作用，TGF-β刺激不僅以Smad 3依賴的方式增加NLRP3的表達(dá)，同時(shí)，TGF-β介導(dǎo)的Smad 2和Smad 3磷酸化需要NLRP3和ASC的參與[16]。如此看來，NLRP3炎性小體激活后對腎纖維化的直接影響似乎越過了炎性反應(yīng)的介導(dǎo)。

在自噬缺陷導(dǎo)致腎纖維化的過程中，若腎細(xì)胞中的自噬激活劑受到抑制，將會激活細(xì)胞焦亡并導(dǎo)致纖維連接蛋白自噬清除功能的損害，而纖維連接蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，將進(jìn)一步導(dǎo)致腎纖維化[17]。

盡管缺乏對于“腎細(xì)胞焦亡-腎炎性反應(yīng)-腎纖維化”的相關(guān)報(bào)道，然而，焦亡分別對于腎炎性反應(yīng)和腎纖維化的獨(dú)立病理環(huán)節(jié)存在推動作用，其中涉及的具體病理機(jī)制，有待進(jìn)一步的探索。

2.4 滑膜纖維化

關(guān)于滑膜組織細(xì)胞焦亡的研究來源于自身免疫性疾病的研究，例如，痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。風(fēng)濕性疾病的致病因素如尿酸單鈉、堿性磷酸鈣、草酸鹽等微晶，可以導(dǎo)致NLRP3炎性小體的激活，啟動巨噬細(xì)胞焦亡及IL-1β的釋放。RA患者的外周血液中即有NLRP3炎性小體的產(chǎn)生，活動型RA患者則具備更高的NLRP3、ASC、活性caspase-1和pro IL-1β水平[18]。目前，RA的滑膜組織中是否存在細(xì)胞焦亡尚為驗(yàn)證，但在RA模型小鼠中，抑制 NLRP3炎性小體的激活可以減輕滑膜炎性反應(yīng)與滑膜纖維化[19]，本團(tuán)隊(duì)率先揭示了膝骨關(guān)節(jié)炎中成纖維樣滑膜細(xì)胞的焦亡介導(dǎo)滑膜炎性反應(yīng)，據(jù)此推測，RA滑膜組織也可能存在焦亡。

3 問題與展望

綜上所述，細(xì)胞焦亡及其在“焦亡-炎性反應(yīng)-纖維化”中的核心作用得到了廣泛的研究。然而，由于缺乏直接的觀察手段，目前的研究對細(xì)胞焦亡的鑒定尚無統(tǒng)一的定論。通過對炎性小體復(fù)合物，GSDMD等焦亡關(guān)鍵物質(zhì)及下游促炎因子的定量分析，結(jié)合細(xì)胞死亡的觀察、DNA斷裂的判定是否能充分肯定細(xì)胞焦亡的發(fā)生仍待進(jìn)一步探索?？梢钥隙ǖ氖?，其介導(dǎo)的炎性級聯(lián)反應(yīng)加劇了組織纖維化的病程進(jìn)展，雖然具體病理機(jī)制有待繼續(xù)闡明，但針對焦亡尋找治療的新方法意義重大。