龐新崗，李永剛*，包倪榮，叢 宇

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.南京總醫(yī)院 骨科，江蘇 南京 210002)

骨質(zhì)疏松是一種以骨量降低和骨脆性增加為特征的骨病，每年世界范圍內(nèi)有超過900萬例骨質(zhì)疏松性骨折，并由此產(chǎn)生巨大的醫(yī)療花費(fèi)[1]。正常情況下骨量維持有賴于骨吸收與骨形成之間平衡的維持，多種因素可打破這一平衡，目前認(rèn)為年齡相關(guān)的骨代謝水平改變及絕經(jīng)后雌激素水平下降、男性睪酮生成減慢是原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因。最初抗骨吸收藥阿倫唑奈等進(jìn)入臨床應(yīng)用并取得一定療效，但同時(shí)也面臨抗骨形成、不能改善骨小梁微結(jié)構(gòu)等問題，隨著對(duì)骨代謝相關(guān)通路研究的深入，新的更具針對(duì)性的藥物如狄諾塞麥、硬化蛋白抗體等已進(jìn)入臨床試驗(yàn)[2]。對(duì)骨代謝相關(guān)通路的研究為骨質(zhì)疏松的治療提供了更多潛在的靶點(diǎn)。

1 Wnt通路

Wnt通路包括經(jīng)典通路 (Wnt/β-catenin)和非經(jīng)典通路[Wnt-平面細(xì)胞極性(planner cell polarity pathway, PCP)通路、Wnt-鈣離子通路]。在經(jīng)典通路中，β-catenin是介導(dǎo)通路激活的關(guān)鍵分子。通路處于失活狀態(tài)時(shí)，糖原合成酶激酶3β(GSK- 3β)、軸蛋白(axin/conductin)、腺瘤樣結(jié)腸息肉蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)及酪蛋白激酶α組配形成降解復(fù)合物，通過與β-catenin N端富含絲氨酸、蘇氨酸區(qū)域結(jié)合介導(dǎo)β-catenin的降解[3]。當(dāng)Wnt蛋白與卷曲蛋白及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)結(jié)合后，散亂蛋白(dishevelled, DSH)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GSK- 3β，導(dǎo)致降解復(fù)合物解聚[4]，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定存在，并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，通過其C端與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，正性調(diào)節(jié)RUNX/Cbfα(runt related transcription factor/core-binding factor) 轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)，RUNX2能通過誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞早期分化及抑制其后期凋亡促進(jìn)成骨分化[5]。

Wnt非經(jīng)典通路包括Wnt-平面細(xì)胞極性(planner cell polarity pathway, PCP)通路及Wnt-鈣離子通路，可通過G蛋白、小G蛋白R(shí)hoA等調(diào)節(jié)鈣依賴蛋白激酶、JUN N端激酶等酶的活性，最終影響過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARγ)、RUNX2以及活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFATC1)等分子的表達(dá)[6]。近來，Wnt非經(jīng)典通路在骨代謝中的作用越來越被重視。如Wnt5a[7]被證實(shí)可以通過酪氨酸激酶孤受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor, Ror)激活JNK通路，募集C-JUN至核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB, RANK)靶基因啟動(dòng)子，介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。

Wnt通路受多種分子調(diào)節(jié)，包括硬化蛋白、分泌型卷曲蛋白相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related protein, SFRP4)、阻黑蛋白(dickkopf 1, DKK1)及RSPO3(R-spondin 3)。硬化蛋白是一種天然的Wnt通路拮抗劑，可負(fù)性調(diào)節(jié)骨分化過程[8]，長(zhǎng)期臥床及雌激素水平下降均會(huì)引起硬化蛋白表達(dá)增加。雌激素不能單獨(dú)調(diào)節(jié)硬化蛋白表達(dá)，但可通過BMPs通路和Wnt/ERα(estrogen receptor)及Wnt經(jīng)典通路，改變RANKL/OPG，影響硬化蛋白表達(dá)[9]。目前針對(duì)硬化蛋白的抗體已進(jìn)入3期臨床試驗(yàn)。一項(xiàng)多中心研究顯示，硬化蛋白抗體Romosozumab顯著提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者腰椎骨密度(較基線增加11.3%)，并且這一效果優(yōu)于阿倫唑奈和特立帕肽(較基線增加4.1%和7.1%)。而血清骨形成標(biāo)志物P1NP在短期內(nèi)迅速增加，并伴隨骨吸收標(biāo)志物水平下降[10]。此外，SFRP4 及DKK1也被證實(shí)可分別通過結(jié)合Wnt蛋白、LRP5/6聚合體抑制Wnt通路激活，而RSPO3可以拮抗DKK1的抑制作用。圍繞SFRP4及 DKK1所制備的抗體尚有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證[11]。

2 BMP通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor, TGF-β)超家族，可通過經(jīng)典的BMP/Smad通路和非經(jīng)典MAPK通路調(diào)節(jié)骨代謝[12]。根據(jù)氨基酸和核苷酸相似性BMPs被分為4個(gè)亞族：BMP2/4、BMP9/10、BMP5/6/7/8、BMP12/13/14。已證實(shí)BMP2與BMP7在促進(jìn)骨愈合方面具有良好的安全性和有效性，并進(jìn)入臨床使用，而BMP3和BMP13被證實(shí)是骨生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)節(jié)分子。

BMPs受體屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，分為1型受體(BMPRIA、BMPRIB和ACVRI)和2型受體(BMPRII、ActrIIA和ActRIIB)，在經(jīng)典途徑中，BMP配體與2型受體結(jié)合，磷酸化1型受體激活下游R-Smads(Smad1,5,8)[13]，R-Smads與Co-Smads形成復(fù)合物轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)RUNX2及Osterix等靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成骨分化。在非經(jīng)典途徑中，BMP通過BMPR1A可以募集TAB1-TAK1復(fù)合物，短時(shí)間內(nèi)激活TAK1/2-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路，調(diào)節(jié)P16INK4a等靶基因表達(dá)，影響成骨分化過程。這一途徑受酪氨酸激酶c-Abl調(diào)節(jié)。C-Abl通過磷酸化BMPR1A羧基端特定的酪氨酸殘基，促使BMPR1A與BMPR2相互作用，激活BMP-Smad通路[14]。BMP通路的促成骨分化作用還與組蛋白去甲基化有關(guān)。BMP4/7可通過Smad上調(diào)間充質(zhì)干細(xì)胞中去甲基酶KDM4B和KDM6B，這兩種去甲基酶通過移除H3K9m3和H3K27m3，募集RNA聚合酶啟動(dòng)DLX與HOX的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)成骨分化相關(guān)的RUNX2與SP7(OSX)的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)增加BMP2和BMP4的表達(dá)，形成正反饋調(diào)節(jié)。

3 RANKL通路

NF-κB是參與免疫和細(xì)胞應(yīng)答的重要轉(zhuǎn)錄因子。在哺乳動(dòng)物中，NF-κB家族包括RelA (p65)、 RelB和 c-Rel、以及前體蛋白NF-κB1(p105)和NF-κB2(p100)，后兩種可被加工成p50 和p52。經(jīng)典途徑中，IKKβ和NEMO(NF-κB essential modulator)引起IκBα磷酸化和P65/P50異源二聚體向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。非經(jīng)典途徑中，NIK(NF-κB-inducing kinase)與IKKα磷酸化P100，并將其加工為P52，釋放RelB/P52復(fù)合物。

RANKL作為腫瘤壞死因子可以通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor-associated factors, TRAFs)及NIK分別參與NF-κB經(jīng)典和非經(jīng)典途徑的調(diào)控[15]。這一過程受多種分子調(diào)控。已證實(shí)，TRAF2,5,6在NF-κB途徑中起正性調(diào)節(jié)作用，而TRAF3則通過抑制NIK-IKKα通路及上調(diào)NF-κB途徑負(fù)性調(diào)節(jié)分子1型IFN的表達(dá)，對(duì)破骨分化產(chǎn)生抑制效應(yīng)[16]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)廣泛參與破骨細(xì)胞分化過程，RANKL可引起白介素表達(dá)增加，導(dǎo)致STAT1,5,6激活并上調(diào)Dusp1和2的表達(dá)，使MAPK通路去磷酸化，最終對(duì)破骨分化產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)[17]。破骨細(xì)胞中存在的Zfp521(zinc finger protein 521)可抑制Ebf1(early B cell factor 1)靶基因Ccl9的表達(dá)，從而阻斷Ccl9對(duì)RANKl通路的增強(qiáng)效應(yīng)[18]。

與Wnt通路相似，RANKL-RANK通路也存在天然拮抗劑OPG。OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員，通過競(jìng)爭(zhēng)性與RANKL結(jié)合抑制RANKL通路，從而抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞的分化、活化，并促進(jìn)其發(fā)生凋亡。既往認(rèn)為OPG由成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌調(diào)控骨轉(zhuǎn)化，但最近研究證實(shí)淋巴細(xì)胞是骨髓中主要的OPG來源。此外，破骨細(xì)胞還存在RANKL的第2受體[19]，即富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體4(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 4, LGR4)，可以與RANK競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL后激活GSK- 3β和Gαq-鈣離子途徑，抑制T細(xì)胞活化核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1, NFATC1)的表達(dá)。

4 NOTCH通路

NOTCH是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命進(jìn)程的進(jìn)化保守的信號(hào)受體，包括NOTCH1- 4 4種亞型，分為胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD，配體為JAG1、JAG2和Delta樣1，3和4，表達(dá)受Wnt等信號(hào)通路調(diào)控。重組信號(hào)結(jié)合蛋白jκ(recombination signal-binding protein jκ，RBPjκ)是NOTCH通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子。NOTCH未激活狀態(tài)下，RBPjκ與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，阻止靶基因轉(zhuǎn)錄。NOTCH與配體結(jié)合后，受γ-分泌酶水解作用釋放NOTCH胞內(nèi)段(notch intracelluar domain, NICD)，NICD向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與RBPjκ結(jié)合，使其與轉(zhuǎn)錄抑制因子解離，啟動(dòng)靶基因HES1和HEY1 等的表達(dá)[20]。

在成骨細(xì)胞中，NOTCH可以抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，這一作用與HES蛋白對(duì)成骨細(xì)胞的吻合。既往研究顯示，HES1轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為成骨不全，但在成熟成骨細(xì)胞中條件敲除HES1可增加骨礦化。

系統(tǒng)性慢性炎性反應(yīng)可引起骨量丟失，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者常伴有明顯骨質(zhì)疏松，這一現(xiàn)象與炎性因子對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)[21]。已證實(shí)炎性反應(yīng)因子如IL1,6、TNFα可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，除此以外，TNFα等還可以通過NOTCH影響成骨細(xì)胞分化。研究發(fā)現(xiàn)[22]，P52/RELB可以與NICD結(jié)合，增強(qiáng)RBPjκ對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)作用，而TNFα可以上調(diào)NF-κB的表達(dá)。通過γ-分泌酶抑制劑阻斷NOTCH通路可以增加動(dòng)物模型的骨密度，這可能為治療骨質(zhì)疏松提供新靶點(diǎn)。

5 通路間相互交聯(lián)構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)

細(xì)胞信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，精確調(diào)控分化過程。在成骨細(xì)胞中，Wnt經(jīng)典通路的靶基因之一JAG1編碼的蛋白是NOTCH信號(hào)通路的重要配體，因而成為NOTCH與Wnt通路關(guān)聯(lián)的重要節(jié)點(diǎn)。而Wnt通路也受到其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。Wnt通路活化過程中需要鈣通道的開放和PKC/ERK的參與，鈣通道蛋白需要在特定半胱氨酸位點(diǎn)發(fā)生巰基化才能發(fā)揮生物學(xué)作用[23]，內(nèi)源性硫化氫是巰基化必需的物質(zhì)，雌激素通過上調(diào)胱硫醚-β-合成酶(CBS)和胱硫醚-γ裂解酶(CSE)水平增加細(xì)胞內(nèi)硫化氫水平，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Wnt通路的調(diào)控。GATA家族是一類與DNA(A/T)GATA(A/G)序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，GATA4是雌激素調(diào)節(jié)TGF-β/BMP/Smads的關(guān)鍵因子，其表達(dá)受雌激素信號(hào)通路調(diào)節(jié)，并協(xié)助雌激素受體與DNA結(jié)合，啟動(dòng)或抑制靶分子如BMP4、BMP6、TGF2/3、BMP受體的轉(zhuǎn)錄[24]。

6 問題與展望

長(zhǎng)久以來，骨質(zhì)疏松癥由于其較高的發(fā)病率和病死率已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在50歲以上的人群中，有1/3的女性和1/5的男性存在骨質(zhì)疏松，而其中有20%左右的老年患者會(huì)因股骨頸骨折死亡。目前臨床廣泛應(yīng)用的雙磷酸鹽類藥物雖然有效抑制骨吸收，但同時(shí)也面臨抗骨形成和不能改善骨小梁微結(jié)構(gòu)等問題。隨著骨代謝相關(guān)通路研究的深入，抗骨質(zhì)疏松藥物的研發(fā)也越來越具有針對(duì)性，從最初阿倫唑奈及特立帕肽的經(jīng)驗(yàn)性用藥到2010年第1次針對(duì)RANKL通路研發(fā)狄諾塞麥，以及目前投入臨床試驗(yàn)的硬化蛋白抗體，使抗骨質(zhì)疏松藥涵蓋抗骨吸收和促骨形成多個(gè)方面，這為逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松病骨量提供可能。此外，隨著炎性反應(yīng)、雌激素水平，氧化應(yīng)激等在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究中的深入，使得部分具有藥理活性的天然化合物,如氯喹和金雀黃素等被用于抗骨質(zhì)疏松藥物的研究。傳統(tǒng)中藥補(bǔ)腎益氣方在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被用于骨質(zhì)疏松的治療，其單體成分的研究也為藥物開發(fā)提供借鑒意義。