智亞楠， 陳月華， 溫亞娟， 馬宇明， 陳利軍， 尹 健

(1.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南信陽 464000； 2.豫南植物有害生物綠色防控院士工作站，河南信陽 464000)

近年來，從植物中尋找殺菌活性物質(zhì)是目前農(nóng)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，植物揮發(fā)油是研究對象之一。植物揮發(fā)油是存在于植物組織中的一類重要的次生代謝物質(zhì)，由分子量較小的簡單化合物組成，常溫下多為油狀液體，易揮發(fā)，具有特征性氣味[1]。多項(xiàng)研究表明揮發(fā)油具有明顯的抗植物病原真菌、細(xì)菌的功能[2-9]。國外已有以揮發(fā)油為活性成分的殺菌劑商品問世[10-11]。揮發(fā)油的抗菌活性與揮發(fā)油的官能團(tuán)等化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[12-13]，因此研究揮發(fā)油的化學(xué)組分及活性對殺菌劑的開發(fā)有一定的啟迪作用。

蒙古蒿[Artemisiamongolica(Fisch.ex Bess.) Nakai]為菊科蒿屬多年生草本植物，多生于中或低海拔地區(qū)的山坡、灌叢、河湖岸邊及路旁等。分布在我國東北、華北和西北各省區(qū)，在河南省信陽市為常見野生植物。蒙古蒿可全草入藥，有溫經(jīng)、止血、散寒、祛濕等作用[14]。蒙古蒿全草含有豐富的揮發(fā)油，目前已有學(xué)者對蒙古蒿揮發(fā)油化學(xué)組分和活性進(jìn)行了研究。1983年師治賢等就對采自青海省的蒙古蒿揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了報(bào)道，報(bào)道中鑒定了50余種化合物，包括α-蒎烯、β-蒎烯、γ-松油烯、樟腦等，但未明確每種化合物的含量[15]。董巖等采用二氧化碳超臨界流體萃取法提取采自山東省德州市蒙古蒿中的揮發(fā)油，并研究了揮發(fā)油對幾種細(xì)菌的抑制活性，經(jīng)鑒定其主要成分為桉樹腦、α-蒎烯、大根香葉烯D等[16]。Liu等報(bào)道了蒙古蒿精油的主要成分是α- 蒎烯、大牛兒烯D和萜品烯等，并測定了其對玉米象的熏蒸殺蟲活性和觸殺活性[17]。

為了掌握河南信陽蒙古蒿揮發(fā)油的組分及抑菌活性，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取蒙古蒿中的揮發(fā)油，用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)分析其化學(xué)組分，并以水稻胡麻斑病菌(Bipolarisoryzae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)4種常見植物病原菌為目標(biāo)菌，測定揮發(fā)油對病原菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，為蒙古蒿在農(nóng)業(yè)上的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 蒙古蒿 蒙古蒿全草于2016年6月采自信陽農(nóng)林學(xué)院桃李園山坡，經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院周巍高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為蒙古蒿(Artemisiamongolica)，采集健康、生長力旺盛的植株帶至實(shí)驗(yàn)室，剪成小于1 cm的小段。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、瓊脂17 g、水1 000 mL。

1.1.3 植物病原真菌 水稻胡麻斑病菌、水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、辣椒炭疽病菌均由信陽農(nóng)林學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 Agilent 6850/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(購自美國安捷倫公司)；NIST14譜庫、HP-250S生化培養(yǎng)箱(購自武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)；KDM-2000 電熱套(購自金壇市恒豐儀器制造有限公司)等。

1.2 蒙古蒿揮發(fā)油的提取

稱取新鮮蒙古蒿植株小段，裝入圓底燒瓶中，采用水蒸氣蒸餾法，連續(xù)提取4 h，得到具有特殊濃郁氣味的深藍(lán)色油狀液體，即為蒙古蒿揮發(fā)油。將揮發(fā)油密封好，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。重?fù)3次。

1.3 揮發(fā)油熏蒸抑制作用測定

蒙古蒿揮發(fā)油對植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用采用生長速率法[4]測定。在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中加入 15 mL 融化的培養(yǎng)基，搖勻制成厚薄均勻平板，平板中央接種1塊植物病原真菌菌餅。然后在皿蓋上放置已滅菌的圓形濾紙片，吸取一定劑量的揮發(fā)油滴加到濾紙片上。對不同的植物病原菌，根據(jù)抑菌預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置不同的揮發(fā)油劑量梯度，以僅放濾紙片不滴加揮發(fā)油為對照。72 h后觀察植物病原真菌的生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%；

利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立毒力回歸方程，并求得相關(guān)系數(shù)和有效中濃度(EC50)，并根據(jù)EC50來比較揮發(fā)油對不同病原真菌的毒力。

1.4 揮發(fā)油GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫，初始柱溫為60 ℃，保持 2 min，以10 ℃/min升溫速率升至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1.0 μL，不分流，進(jìn)樣前揮發(fā)油用乙醚適當(dāng)稀釋。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古蒿揮發(fā)油組分GC-MS分析

利用GC-MS對蒙古蒿揮發(fā)油組分進(jìn)行分析，總離子流量如圖1所示。利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對，并結(jié)合化學(xué)物質(zhì)登錄號(hào)(CAS號(hào))分析，從蒙古蒿揮發(fā)油中共分離到33個(gè)組分，鑒定出了其中的29個(gè)組分(表1)，占揮發(fā)油總量的95.602%。

從表1可看出，蒙古蒿揮發(fā)油中相對含量最高的組分為蘭香油薁(16.59%)，其次為大根香葉烯D(14.916%)，再次為石竹烯(9.615%)、桉樹腦(8.782%)和順式-菊烯醇(6.014%)等。在鑒定出的29種化合物中，以萜類化合物為主，其中倍半萜類化合物14種，占揮發(fā)油總量的43.381%；其次是單萜類化合物9種，占揮發(fā)油總量的31.381%；薁類化合2種，占揮發(fā)油總量的17.115%，另外還有酯類等化合物。

2.3 蒙古蒿揮發(fā)油對植物病原真菌的熏蒸抑制作用

用生長速率法測定蒙古蒿揮發(fā)油對4種植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，測定結(jié)果見圖2、表2。由表2可知，蒙古蒿揮發(fā)油對供試病原菌均有一定的熏蒸抑制作用，試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)抑制作用隨揮發(fā)油劑量增加而增強(qiáng)。在5.0 μL/皿劑量下，揮發(fā)油對水稻紋枯病菌的抑制率最高，達(dá)到 60.42%，對水稻胡麻葉斑病菌的抑菌率最低，為29.02%。在10.0 μL/皿劑量下，揮發(fā)油對水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用較明顯，抑菌率分別為73.45%和71.77%。在12.0 μL/皿劑量下?lián)]發(fā)油對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和辣椒炭疽病菌的抑制率均達(dá)到75%以上，而水稻胡麻斑病菌要在劑量為15.0 μL/皿下，抑制率才能達(dá)到73.71%。

表1 蒙古蒿揮發(fā)油的化學(xué)組分分析

表2 蒙古蒿揮發(fā)油對4種植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用

蒙古蒿揮發(fā)油對植物病原真菌菌絲生長的毒力測定結(jié)果見表3。從EC50分析可知，蒙古蒿揮發(fā)油對水稻紋枯病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50僅為3.05 μL/皿，其次是小麥赤霉病菌，EC50為5.20 μL/皿，揮發(fā)油對辣椒炭疽病菌的抑制作用相對較弱，EC50為6.98 μL/皿，對水稻胡麻斑病菌的抑制作用最弱，EC50為9.01 μL/皿。

表3 蒙古蒿揮發(fā)油對4種植物病原真菌菌絲生長的毒力測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究通過水蒸氣蒸餾法提取蒙古蒿的揮發(fā)油，采用 GC-MS 對蒙古蒿揮發(fā)油化學(xué)組分進(jìn)行分離鑒定，主要組分為蘭香油薁(16.590%)、大根香葉烯D(14.916%)、石竹烯(9.615%)、桉樹腦(8.782%)和順式-菊烯醇(6.014%)等。與青海[15]、山東[16]等地產(chǎn)蒙古蒿揮發(fā)油的主要化學(xué)組分有所不同，主要區(qū)別在于本研究鑒定出的含量最高的成分蘭香油薁在其他蒙古蒿揮發(fā)油的研究中未見報(bào)道。這些區(qū)別可能與試驗(yàn)材料的生境、采收時(shí)間、前處理方式有關(guān)。蘭香油薁主要存在于甘菊、白蒿等植物中，具有抗炎、抗過敏的作用[18-21]。蘭香油薁為藍(lán)色黏稠液體，難溶于水[18]，本研究提取的揮發(fā)油即為深藍(lán)色，推測是蘭香油薁顏色的體現(xiàn)。其他主要成分中大根香葉烯D[22-23]和桉樹腦[24]具有顯著的抑菌活性，石竹烯[25]對棉蚜有毒殺活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，信陽野生的蒙古蒿揮發(fā)油對供試的4種植物病原真菌均有強(qiáng)烈的熏蒸抑制作用，對水稻紋枯病病菌、小麥赤霉病病菌、辣椒炭疽病病菌和水稻胡麻斑病病菌4種真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用的EC50介于3.05～9.01 μL/皿之間，其中對水稻紋枯病病菌和小麥赤霉病病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50僅為3.05和5.20 μL/皿。因此，利用蒙古蒿揮發(fā)油明顯的抑菌作用有望研發(fā)出熏蒸劑應(yīng)用于植物病害防控。本試驗(yàn)僅是對蒙古蒿揮發(fā)油的抗菌活性做了初步的研究，由于其化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性，有關(guān)蒙古蒿揮發(fā)油抗植物病原真菌的活性機(jī)制、組分間互作及其他生物活性試驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

前人研究表明，多種蒿屬植物均具有廣譜的抗菌、殺蟲作用[1，5，26-30]，例如黃花蒿、艾蒿、茵陳蒿、大籽蒿、白草蒿、銀葉艾蒿等；本研究的試驗(yàn)材料蒙古蒿也被證實(shí)其溶劑粗提物對舞毒蛾具有毒殺活性[30]；其精油浸膏有驅(qū)蚊活性[31]；其乙醇提取物對丁香假單胞菌、根癌土壤桿菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌具有一定的抑制活性[26]。隨著對蒿屬植物研究的不斷深入，一些新的技術(shù)和手段不斷應(yīng)用于這一領(lǐng)域，隨著其有效成分提取和分析檢測技術(shù)的提高，蒿屬植物的開發(fā)利用將擁有廣闊的前景。