顧國(guó)海， 李夢(mèng)莎

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇蘇州 215008； 2.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，黑龍江哈爾濱 150040)

土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一[1]，是土壤元素循環(huán)與轉(zhuǎn)化的主要?jiǎng)恿χ籟2-3]，在生態(tài)系統(tǒng)功能以及全球生態(tài)系統(tǒng)地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。土壤微生物群落多樣性反映了土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的變化[6]，而通過(guò)對(duì)土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，能夠?yàn)榻鉀Q生態(tài)系統(tǒng)功能的變化，制定保護(hù)和合理利用濕地資源的措施提供理論基礎(chǔ)[7-9]。因此，研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能多樣性，對(duì)評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量、生態(tài)系統(tǒng)功能和土壤元素循環(huán)具有重要意義[10-11]。

濱海濕地是我國(guó)重要的濕地之一，具有顯著的區(qū)域特性。本試驗(yàn)選擇3個(gè)典型的濕地類型-蘆葦濕地、堿蓬濕地、互花米草濕地分別設(shè)立樣地，采集表層0～20 cm的土壤，采用Biolog-ECO微平板檢測(cè)法分析土壤微生物群落功能多樣性的變化規(guī)律，探討其差異的形成機(jī)制，以期全面了解和評(píng)價(jià)濱海濕地土壤微生物的分布特點(diǎn)。研究結(jié)果將為進(jìn)一步闡明濱海不同類型濕地土壤微生物分布特征提供理論基礎(chǔ)，為濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)樣地位于江蘇省鹽城國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)?？偯娣e約為247 260 hm2，其中核心區(qū)面積22 596 hm2，緩沖區(qū)面積56 742 hm2，試驗(yàn)區(qū)面積167 922 hm2。保護(hù)區(qū)位于江蘇省鹽城市境內(nèi)，范圍在119°53′45″～121°18′12″E，32°48′47″～34°29′28″N 之間。保護(hù)區(qū)地處暖溫帶與北亞熱帶過(guò)渡地帶，主要受海洋與大陸性氣候影響，年平均氣溫為 13.7～14.6 ℃，年平均降水量1 000 mm，雨量集中在夏季，冬天多干旱。夏季(3月至8月份)涼爽，冬季(9月至次年2月)溫暖。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)站內(nèi)選擇3個(gè)20 m×20 m代表樣地，分別為蘆葦濕地(LW)、堿蓬濕地(JP)以及互花米草濕地(MC)。于2014年8月采集土壤樣品，用直徑為4 cm的土鉆按混合采樣法采集0～20 cm土層，每個(gè)土樣由5個(gè)采集點(diǎn)的土壤混合，混勻后用四分法取適量于封口袋中，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。采集的土樣一部分保存在4 ℃條件下，用于分析土壤微生物群落功能多樣性；另一部分風(fēng)干、磨細(xì)，過(guò)100目篩用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)(表1)。

1.3 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用Biolog-ECO微平板法對(duì)不同類型濱海濕地土壤微生物功能多樣性進(jìn)行分析。具體方法參照Classen等的方法[11]。首先土壤樣品在25 ℃活化24 h，稱取約10 g烘干土的新鮮土樣加入內(nèi)有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，加無(wú)菌棉花塞后，將三角瓶在旋渦振蕩器上震蕩1 min，然后置于冰水浴中1 min，反復(fù)3次。靜置2 min后按逐步稀釋法，依次稀釋為10-2和10-3的土壤懸浮液。用八通道移液器向ECO板每孔中加入10-3的土壤懸浮液，接種量為150 μL，將接種好的微孔板放在(25±1) ℃下連續(xù)培養(yǎng)13 d，每隔 24 h 用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處的吸光度。

土壤pH值測(cè)定時(shí)水土比為2.5 mL ∶1 g；土壤含水率采用烘干法測(cè)定；土壤有機(jī)碳利用碳氮分析儀測(cè)定(耶拿-2100S， 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)； 土壤中全氮采用半微

表1 不同濕地類型下的土壤理化性質(zhì)

量凱氏定氮法測(cè)定；硝態(tài)氮采用酚二磺酸比色法測(cè)定；銨態(tài)氮采用氯化鉀浸提-靛酚藍(lán)比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

微生物代謝強(qiáng)度采用平均顏色變化率(average well color development，簡(jiǎn)稱AWCD)來(lái)描述，是利用單一碳源能力的重要指標(biāo)。采用Biolog微平板培養(yǎng)168 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，此時(shí)即使生長(zhǎng)較慢的微生物也已參與碳源的代謝過(guò)程，因此能較全面地反映微生物群落的信息。采用Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)來(lái)表征土壤微生物群落代謝功能多樣性。

平均顏色變化率[12-14]：AWCD=∑(Ci-R)/31；

Shannon多樣性指數(shù)[15-16]：H=PilnPi；

Simpson多樣性指數(shù)[16]：D=1-∑(Pi)2；

式中：Ci為第i個(gè)碳源孔吸光度；R為對(duì)照孔吸光度，若Ci-R≤0，計(jì)為0；ni是第i孔的相對(duì)吸光度；Pi為ni與整個(gè)平板相對(duì)吸光度總和的比率。

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和單因素方差分析(one-way ANOVA)，用S-N-K法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為α=0.05；繪圖采用Sigmaplot 12.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物對(duì)碳源利用的動(dòng)力學(xué)特征

從圖1可以看出，培養(yǎng)期間AWCD隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，其中，24～168 h期間AWCD值快速增加，說(shuō)明微生物不斷適應(yīng)ECO板各孔的環(huán)境，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大量碳源被利用，此時(shí)微生物代謝活性旺盛；隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，168 h以后土壤微生物緩慢步入穩(wěn)定期。比較不同濕地類型土壤微生物群落AWCD發(fā)現(xiàn)，蘆葦濕地>堿蓬濕地>互花米草濕地，說(shuō)明隨著陸-海濕地類型的改變土壤微生物碳代謝活性逐漸降低。

2.2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

土壤微生物群落對(duì)不同碳源的利用情況可以用多樣性指數(shù)表示。表2中顯示了土壤微生物在培養(yǎng)168 h時(shí)的Shannon、Simpson和McIntosh多樣性指數(shù)，可在數(shù)量特征上相對(duì)反映土壤微生物群落物種組成和個(gè)體數(shù)量分布的情況。結(jié)果顯示，在3個(gè)類型的濕地中，隨著由陸-海濕地類型的轉(zhuǎn)變，土壤微生物Shannon多樣性指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。其中，蘆葦濕地的土壤微生物Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)均最高，堿蓬濕地次之，互花米草濕地最低，從Shannon指數(shù)來(lái)看，蘆葦濕地僅與堿蓬濕地差異顯著，而與互花米草濕地差異不顯著；從McIntosh指數(shù)來(lái)看，蘆葦濕地僅與互花米草濕地差異顯著，與堿蓬濕地差異不顯著。而不同類型濕地的Simpson指數(shù)間差異不顯著。

表2 土壤微生物群落多樣性指數(shù)

2.3 土壤微生物群落對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度

Biolog-ECO板中含有31種碳源，包括碳水化合物類(10種)、氨基酸類(6種)、羧酸類(7種)、多聚物(4種)、酚酸類(2種)和胺類(2種)。由圖2可知，不同類型濕地土壤微生物群落對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度明顯不同，植被類型是影響不同碳源利用強(qiáng)度的重要因素。隨著濕地植被類型的變化，濱海濕地對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。其中，蘆葦濕地對(duì)于碳水化合物類、氨基酸類、多聚物的利用率最大；堿蓬濕地對(duì)碳水類利用率最大；互花米草濕地對(duì)多聚物類利用強(qiáng)度最大。整體來(lái)看，土壤微生物對(duì)碳水化合物類利用最多，其次是氨基酸類和多聚物，對(duì)羧酸類、酚酸類、胺類的利用則相對(duì)較少，可見濱海濕地土壤微生物比較偏好的碳源類型為碳水化合物類、氨基酸類和多聚物。

2.4 不同類型濕地土壤微生物群落功能主成分分析

對(duì)培養(yǎng)168 h的AWCD值進(jìn)行微生物群落功能主成分分析(principal component analysis，簡(jiǎn)稱PCA)，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為82.18%和10.82%，累積方差貢獻(xiàn)率為93.00%，說(shuō)明PC1和PC2是微生物群落碳源利用變異的主要來(lái)源，可以解釋變異的絕大部分信息。從圖3可以看出，不同類型濕地土壤微生物群落在碳源利用上有明顯的空間分異，而且在PC1和PC2上的得分系數(shù)均有明顯差異，可見土壤微生物群落碳代謝特征受到不同濕地類型的明顯影響。在PC2軸上，各樣地土壤微生物碳源利用的主成分分析得分排序?yàn)榛セ撞轁竦?堿蓬濕地>蘆葦濕地，與AWCD值和多樣性指數(shù)的分析結(jié)果一致，總體呈現(xiàn)隨不同濕地類型的改變碳源利用活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。不同類型濕地土壤微生物群落明顯分為3簇。

按照相關(guān)性系數(shù)絕對(duì)值大于0.85的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PC1和PC2進(jìn)行分析，從表3可以看出，與PC1具有較高相關(guān)性的碳源有13種，其中碳水化合物類6種、氨基酸類1種、羧酸類3種、多聚物1種、酚酸類2種；與PC2具有較高相關(guān)性的碳源有6種，包括碳水類1種、氨基酸類2種、羧酸類2種、胺類1種。綜合PC1和PC2結(jié)果可知，不同類型濕地中對(duì)土壤微生物群落代謝功能起作用的主要碳源類型為碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類，不同類型濕地的差異主要體現(xiàn)在對(duì)碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用上，其中碳水化合物類最為突出。

2.5 土壤微生物代謝特性與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

將土壤有機(jī)碳含量、全氮含量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量、含水率和pH值與土壤微生物群落多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。由表4可知，Shannon多樣性指數(shù)與pH值呈正相關(guān)關(guān)系，而與有機(jī)碳含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Simpson多樣性指數(shù)與有機(jī)碳含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Mclntosh多樣性指數(shù)與全氮含量正相關(guān)；微生物的代謝活性(用AWCD表示)與pH值、有機(jī)碳含量和全氮含量正相關(guān)。

3 討論

土壤微生物群落多樣性是反映土壤肥力、土壤環(huán)境變化過(guò)程的重要指標(biāo)之一，可以很好地揭示不同生態(tài)系統(tǒng)在微生物上的功能差異，在生態(tài)系統(tǒng)功能中具有重要的意義。在本研究中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AWCD值逐漸上升，且隨著蘆葦濕地-堿蓬濕地-互花米草濕地的變化，AWCD值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這與鄭華等研究不同森林土壤微生物群落多樣性變化的結(jié)果一致[18]。說(shuō)明土壤養(yǎng)分的差異是影響土壤微生物功能活性的主要因素之一。

Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)和McIntosh多樣性指數(shù)分別表征土壤中微生物群落的豐富度、優(yōu)勢(shì)度以及均勻度[6]。在3個(gè)不同濕地類型中，蘆葦濕地與堿蓬濕地Shannon多樣性指數(shù)差異顯著；蘆葦濕地與互花米草濕地McIntosh多樣性指數(shù)差異顯著。這說(shuō)明土壤理化性質(zhì)影響了微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，這與很多研究的結(jié)果[19-20]一致。也就是說(shuō)，土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物的活性以及結(jié)構(gòu)都具有重要的影響。

表3 31種碳源與PC1、PC2的相關(guān)系數(shù)

表4 土壤微生物多樣性指數(shù)與理化性質(zhì)的相關(guān)性

土壤微生物群落對(duì)不同類型碳源的利用強(qiáng)度存在一定的差異，3個(gè)不同濕地類型中，土壤微生物對(duì)碳水化合物類的利用率最高，為優(yōu)勢(shì)碳源，主要包括β-甲基-D-葡萄糖苷、D- 半乳糖酸-γ-內(nèi)脂、D-木糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、α-D-乳糖；3個(gè)不同濕地類型微生物功能多樣性的差異主要體現(xiàn)在對(duì)碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用上，這與左平等的研究結(jié)論[21]，即不同生境條件下土壤微生物對(duì)碳源的利用率有所不同，不同濕地土壤微生物功能上的差別是由各微生物群落對(duì)碳源的總體利用率產(chǎn)生的差別[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，互花米草濕地胺類的利用效率也占到了20%以上，且對(duì)碳源的利用率具有很強(qiáng)的選擇性，這都說(shuō)明在淹水環(huán)境中土壤微生物的多樣性比較低，對(duì)碳源的利用具有選擇性；而蘆葦濕地和堿蓬濕地土壤微生物對(duì)碳源的利用率比較均衡。這說(shuō)明土壤微生物所表現(xiàn)出的對(duì)碳源利用的不一致性是受到植物多樣性和土壤性質(zhì)的影響，受到多因素控制。

由土壤微生物對(duì)31種碳源的利用主成分分析得知，3個(gè)不同濕地類型的土壤微生物對(duì)碳源的利用特征差異比較明顯，這一點(diǎn)可能和樣地的生境特征有一定的關(guān)系。隨著濕地類型的變化，濕地的物種多樣性發(fā)生了變化，因此作為主要輸入碳源的凋落物的組成和含量發(fā)生了比較明顯的變化，進(jìn)而使土壤微生物代謝特征發(fā)生一定的改變，使其對(duì)碳源利用的種類和強(qiáng)度均發(fā)生變化。左平等指出，地上植物的多樣性會(huì)通過(guò)凋落物的差異對(duì)土壤微生物功能代謝產(chǎn)生重要影響[21-22]。此外，通過(guò)對(duì)土壤微生物的多樣性指數(shù)和AWCD值進(jìn)行主成分分析，3個(gè)不同濕地類型明顯出現(xiàn)分化，更有力地證明了濕地條件下物種多樣性的組成會(huì)對(duì)土壤微生物的組成和功能活性產(chǎn)生重要的影響。

綜上所述，不同類型濕地土壤微生物群落代謝特征具有較為明顯的地帶性差異。不同類型濕地由于其生境的差異，導(dǎo)致土壤理化以及植物群落組成發(fā)生了變化，這些是影響土壤微生物代謝活性的主要因素。由于Biolog-Eco微平板技術(shù)的局限性，僅采用此技術(shù)很難完整地反映不同濱海濕地土壤微生物群落功能多樣性的變化規(guī)律。目前隨著其他技術(shù)手段的快速發(fā)展，結(jié)合多種微生物學(xué)研究方法，如磷酸脂肪酸(phospholipid fatty acid，簡(jiǎn)稱PLFA)譜圖分析法和分子生物學(xué)技術(shù)(如宏基因組技術(shù))，將為完整了解鹽城濱海濕地微生物群落結(jié)構(gòu)和功能等信息提供很好的方法。