王瑜瓊 李沛哲 王 琪 郭 姍 趙瑞君** 程璟俠

(1.山西醫(yī)科大學，山西太原 030001； 2.山西省疾病預防控制中心病媒生物防控科，山西太原 03000l)

惡性腫瘤是導致數(shù)以百萬計人死亡的重要原因之一。對腫瘤患者的放、化療可對正常的組織及細胞產(chǎn)生毒副作用(Cassidyetal.,2002)。瑞典科學家Boman等分離得到天蠶素(Cecropin)抗菌肽A和B后,人們開始對抗菌肽有新的認識(Houetal., 2017)。昆蟲抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一種從昆蟲血淋巴中提取出來的天然多肽，分子量小，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易被消化酶水解，不易產(chǎn)生耐藥性，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分(Mulderetal.,2013)。對昆蟲抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)它有一系列常用腫瘤療法所沒有的優(yōu)點對昆蟲抗菌肽的研究發(fā)現(xiàn)它有一系列常規(guī)腫瘤療法所沒有的優(yōu)點，專家們紛紛將目光轉(zhuǎn)向抗菌肽，這種獨特的昆蟲抗菌肽資源受到廣泛重視，研究內(nèi)容集中在昆蟲抗菌肽的分類方法、結構特征、生物學活性檢驗、抗腫瘤機制、前景展望等方面。

1 昆蟲抗菌肽的分類及結構特點

昆蟲在受到免疫刺激后，血淋巴可以產(chǎn)生具有抗菌、抗腫瘤活性的多肽類物質(zhì)——抗菌肽。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在鱗翅目、膜翅目、等翅目等昆蟲中均有抗菌肽的存在。根據(jù)結構和功能的不同,可分為4大類:天蠶素類抗菌肽、昆蟲防御素類抗菌肽、富含脯氨酸的抗菌肽、富含甘氨酸的抗菌肽。天蠶素類抗菌肽,分子內(nèi)含有2個兩性α螺旋結構,不含半胱氨酸,分子量在4 kDa左右,可作用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌(Lauthetal.,1998)。防御素類抗菌肽,具有α螺旋結構和β折疊結構,分子量為4 kDa,對革蘭氏陽性菌具有抗菌活性(Bonmatinetal.,1992)。富含脯氨酸的抗菌肽類,可分成2個家族，即短鏈(小于20個氨基酸)和長鏈(大于20個氨基酸)，由15～34個氨基酸組成, 分子量為2～4 kDa,只作用于革蘭氏陰性菌(Buletetal., 2005)。目前，鱗翅目、雙翅目、半翅目、膜翅目中均已提取出富含脯氨酸的抗菌肽。富含甘氨酸的抗菌肽類一級結構中都富含甘氨酸,分子量為10～30 kDa,可對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抗菌作用(Breyetal.,1998)。

2 昆蟲抗菌肽的抗腫瘤生物學活性檢驗

昆蟲抗菌肽可以非特異性殺傷腫瘤細胞而對正常體細胞無毒性影響，這預示著抗菌肽作為一種新型抗腫瘤藥物在臨床應用中具有光明的前景。王文健等(2015)用家蠅Muscadomestica幼蟲抗菌肽對腫瘤細胞sup-b15急淋白血病小鼠模型進行實驗，發(fā)現(xiàn)該抗菌肽具有增殖抑制及誘導凋亡的作用。包永芬等(2010)將草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda卵細胞系SF-9產(chǎn)生的抗菌肽作用于荷人宮頸癌細胞 SiHa 裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)隨著作用時間的延長, 腫瘤細胞增殖速度逐漸減慢,呈劑量—效應關系和時間—效應關系。趙瑞君等(2007)提取家蠅成蟲體內(nèi)的抗菌肽并作用于腫瘤細胞K562(人髓樣白血病細胞株)、Daudi(人淋巴瘤細胞株)、109(人食管癌細胞株)及T24(人膀胱癌細胞株),實驗發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽對癌細胞109和癌細胞Daudi的殺傷率比對照組高40%～60%,對癌細胞K562和癌細胞T24的殺傷率可達到10%～20%。為研究小菜蛾抗菌肽對人肝癌細胞株HepG2的作用，肖云芝等(2015)通過MTT比色法觀察小菜蛾Plutellaxylostella抗菌肽溶液對HepG2肝癌細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)其可對肝癌細胞株HepG2增殖的產(chǎn)生抑制作用。焦莉萍等(2012)用MTT法檢測不同濃度家蠅抗菌肽防御素對SW480、SIHA、HepG2三種腫瘤細胞及正常人心肌細胞HCM的作用效果，發(fā)現(xiàn)在不同濃度抗菌肽MD的作用下，腫瘤細胞的生長均受到抑制，正常人心肌細胞HCM無抑制現(xiàn)象。杜斌等(2015)用家蠅幼蟲抗菌肽粗提取物作用于原代FBL-3細胞，顯微鏡下觀察到原代FBL-3細胞的細胞膜產(chǎn)生孔洞。其細胞周期表現(xiàn)為G0/G1期的細胞比例增加，S期的細胞比例下降。

3 昆蟲抗菌肽的作用機制

從瑞典科學家初次發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來，它的抗腫瘤作用機制逐漸清晰，傾向于聯(lián)合多種理論來解釋。

3.1 對細胞膜的作用

目前，抗菌肽的膜損傷作用是眾多研究者普遍認為的主要作用機制，學術界較為認同的主要有“氈毯”模型、“通道”模型和“桶板”模型(尹昆侖等，2015)。(1)腫瘤細胞表面的磷脂酰絲氨酸帶有負電荷(Leuschneretal., 2004)。抗菌肽分子具有帶正電荷的兩親α雙螺旋結構，腫瘤與抗菌肽相互吸引并結合，整個腫瘤細胞膜被昆蟲抗菌肽充分包裹，形成“氈毯”樣結構?！皻痔骸毙纬赡z束狀物質(zhì)，降低腫瘤細胞膜表面張力，從而使得其細胞膜遭到破壞。(2)抗菌肽分子的羧基和氨基端兩親α螺旋插入到腫瘤細胞的細胞膜內(nèi)，形成超分子復合物，這就是所謂的“通道”模型(Matsuzaki, 1998)。(3)在“通道”模型的基礎上，多個抗菌肽分子彼此聚合作用形成圓桶狀聚合體，腫瘤細胞膜的結構被擾亂。此時即形成電勢依賴性離子孔道，細胞內(nèi)容物大量外流，細胞滲透壓難以維持，細胞崩解死亡。這就是所謂的“桶板”模型(Ehrensteinetal.,1977)。

3.2 對染色體DNA的作用

抗菌肽可以有效抑制腫瘤細胞DNA的復制。王芳等(1998)證實了腫瘤細胞K562的DNA序列可被抗菌肽CM4分離，而正常細胞卻不受其影響，充分說明了抗菌肽可特異性抑殺腫瘤細胞。劉忠淵等(2008)的實驗發(fā)現(xiàn)新疆家蠶Bombyxmori抗菌肽可以與DNA雙螺旋的凹槽結合，使DNA雙螺旋結構松散，堿基對的排列順序紊亂。

3.3 對細胞骨架的作用

Chen等(2003)研究發(fā)現(xiàn)天蠶素抗菌肽B3可使腫瘤細胞微管破裂，也就是說抗菌肽可通過對細胞骨架的破壞作用來抑制腫瘤細胞?？咕牡膿p傷作用對腫瘤細胞和人體正常細胞的細胞骨架均會產(chǎn)生，由于腫瘤細胞的細胞骨架不能及時進行自我修復，而人體正常細胞的細胞骨架系統(tǒng)完整發(fā)達，故不會造成嚴重的損傷。

3.4 對線粒體的作用

線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，抗菌肽可以破壞腫瘤細胞的線粒體。線粒體膜結構中的磷脂酸、磷脂酰乙醇胺等成分屬于負電荷磷脂的范疇(Van Meeretal., 2008)，而前已述腫瘤細胞膜磷脂分子帶負電荷，正負電荷的靜電吸引作用導致線粒體膜發(fā)生破壞。由于膜電位的降低，能量代謝功能發(fā)生障礙，最終導致腫瘤細胞死亡。Huang等(2011)發(fā)現(xiàn)豹毒素作用于線粒體膜產(chǎn)生孔道，導致線粒體膜電勢降低，細胞色素C的大量釋放，活性氧大量釋出，HT-1080的凋亡激活，抗腫瘤作用產(chǎn)生。

3.5 提高抗體免疫效應

抗菌肽在抑腫瘤過程中還發(fā)揮著促進機體固有免疫和獲得性免疫的作用(Alvarezcalderonetal., 2013)?？咕目梢栽鰪娞岢始毎奶岢屎蛿z取能力，增強NK細胞的殺傷活性；增強腫瘤抗原的免疫原性，消除機體對腫瘤抗原的免疫耐受性，最終加強對腫瘤細胞的抑殺效果；作為抗腫瘤細胞的免疫佐劑。

4 基因工程抗菌肽的設計與發(fā)展

鑒于抗菌肽在昆蟲體內(nèi)含量極微，提取工藝復雜，成本較高，耗時較長，不方便大規(guī)模生產(chǎn)的困難，利用基因工程技術制備抗菌肽是可能的途徑之一。其中，高效的表達系統(tǒng)是制約抗菌肽基因工程生產(chǎn)的重要因素。(1)原核表達。由于大腸桿菌具有遺傳背景清晰、可以快速高密度培養(yǎng)、外源性基因易于表達、操作簡單等優(yōu)點，因此，常用于抗菌肽基因的表達。目前多采用融合表達技術來生產(chǎn)抗菌肽(Choetal., 2014)。(2)真核表達。酵母表達系統(tǒng)是常見的真核表達系統(tǒng)。但是酵母的高密度培養(yǎng)很難實現(xiàn)，且抗菌肽在酵母中表達會發(fā)生酰胺化不完全的現(xiàn)象(Elisaetal., 2014)。CHO細胞是目前公認的較理想的真核表達系統(tǒng), 表達的生物蛋白與天然蛋白分子相比，在分子結構、抗腫瘤生物活性等方面比較相似，可以準確地轉(zhuǎn)錄和修飾目的蛋白。

5 展望

昆蟲繁殖力強容易飼養(yǎng)，是提取制備抗菌肽的適宜來源。家蠅抗菌肽具有相對穩(wěn)定的理化性質(zhì),受溫度影響小,耐高濃度鹽液和較極端的pH溶液，不易被消化酶水解，這些特點為人類的儲存、運輸抗菌肽提供了便利的條件(Chuetal., 2004)。令人欣慰的是針對抗菌肽的研究和開發(fā)已經(jīng)取得了令人矚目的成就。Pexiganan是一種爪蛙素衍生物，在治療糖尿病足部潰瘍時的療效可以與抗生素氧氟沙星媲美(Wenetal., 2016), 如馬蓋寧公司研發(fā)的對糖尿病性足潰瘍有效的抗菌肽Pexiganan已完成Ⅲ期臨床試驗，Xoma公司的對細菌性腦膜炎有效的抗菌肽rBPI21及Migenix公司的對導管插入感染有效的抗菌肽Omiganan也都完成了Ⅲ期臨床試驗。

昆蟲抗菌肽應用于臨床腫瘤治療的過程中還存在著許多問題：(1)昆蟲抗菌肽在體內(nèi)的活性和抗腫瘤效能是否與體外試驗一致，是需要進一步探討的內(nèi)容。(2)從昆蟲中提取昆蟲抗菌肽成本較高，尚需尋找一種經(jīng)濟、高效的替代制備方法。(3)昆蟲抗菌肽在臨床應用前還需進行相關的藥理、毒理實驗。昆蟲抗菌可能會成為抗腫瘤治療過程中一個重要選項。