王 娜 ，李 姣 ，王小武 ，郭 晶 ，趙明禮 ，郝少強(qiáng) ，郭春明 ，馬 毅

（1.天津中科博雅生物育種研究有限公司 300457；2.全國畜牧總站 100125；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所 300384）

在牛繁殖領(lǐng)域，大量進(jìn)行體外胚胎生產(chǎn)已有近30年的歷史，但這主要作為研究手段，一方面用來了解體內(nèi)胚胎正常發(fā)育的過程，另一方面作為其他生物技術(shù)（如轉(zhuǎn)基因、克隆等）的研究材料[1]。然而近年來，牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)越來越得到眾多科研人員的重視，也取得了顯著性的研究成果。國外一些發(fā)達(dá)國家已成功將該技術(shù)應(yīng)用于牛生產(chǎn)實(shí)踐，而我國仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，盡管有將體外受精胚胎進(jìn)行移植并順利妊娠產(chǎn)下犢牛的報(bào)道，但仍處于初期探索階段[2]。因此，為加快我國牛良種繁育進(jìn)程和擺脫人們?nèi)找鎸?duì)進(jìn)口牛類畜產(chǎn)品的依賴，現(xiàn)階段亟需將該技術(shù)與胚胎移植、活體采卵（OPU）技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，推廣應(yīng)用。

與體內(nèi)胚胎相比，體外胚胎移植后的妊娠率顯著低于體內(nèi)胚胎移植后的結(jié)果，其根源在于體外胚胎移植后建立和維持妊娠的能力，這也是限制體外胚胎用于生產(chǎn)實(shí)踐的關(guān)鍵因素[3-4]。牛體外胚胎生產(chǎn)主要由卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)等三個(gè)關(guān)鍵步驟組成，這三個(gè)步驟的順利進(jìn)行與胚胎移植后的存活及成功妊娠密切相關(guān)。因此，本文總結(jié)了上述三個(gè)環(huán)節(jié)中影響胚胎產(chǎn)量和質(zhì)量的因素，以期為后續(xù)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化研究和推廣應(yīng)用提供參考。

1 卵母細(xì)胞體外成熟

1.1 卵母細(xì)胞來源

胚胎的大部分遺傳物質(zhì)來源于卵母細(xì)胞，因此，卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力直接影響體外受精和囊胚形成效率，所以，在一定程度上胚胎的發(fā)育潛力在受精時(shí)就已經(jīng)被決定了[3]。卵母細(xì)胞發(fā)育潛力也稱卵母細(xì)胞質(zhì)量，研究表明，卵母細(xì)胞來源對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量有顯著影響，不同來源的卵母細(xì)胞，其質(zhì)量差別也較大[1]。未成熟卵母細(xì)胞的來源主要有兩種途徑，一是從屠宰場(chǎng)卵巢中獲取，利用切割或抽吸法獲取卵巢表面2～8mm卵泡內(nèi)的卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）進(jìn)行體外成熟[5]。該方法取材容易、成本低，但很難確定卵母細(xì)胞的系譜，常用于體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系的優(yōu)化研究。二是OPU，即借助B超引導(dǎo)、真空泵抽吸的方式，通過陰道穹隆進(jìn)行卵巢穿刺采卵。該方法需要一定的操作技巧，對(duì)技術(shù)人員的要求較高。操作過程中若真空泵壓力過大，會(huì)導(dǎo)致卵丘細(xì)胞丟失，裸卵率較高；壓力過小則不易抽出卵母細(xì)胞，影響回收效率。因此，需要不斷調(diào)整真空泵的壓力，以獲取數(shù)量多且質(zhì)量好的COCs。而目前的研究結(jié)果顯示，屠宰場(chǎng)卵巢獲得的COCs體外成熟效果要優(yōu)于OPU來源的COCs[6]。這一結(jié)果可能與獲取卵母細(xì)胞時(shí)的卵泡大小和卵丘細(xì)胞特征有關(guān)，因?yàn)槁雅荽笮『吐亚鸺?xì)胞特征是影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要因素[4]。但現(xiàn)階段在不損傷卵母細(xì)胞的情況下，通過卵泡大小和卵丘細(xì)胞特征來評(píng)估COCs后續(xù)發(fā)育能力的標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，仍需更多更深入的研究。

1.2 體外成熟條件

卵泡內(nèi)的微環(huán)境和母體之間通過信號(hào)傳遞來支持卵母細(xì)胞生長(zhǎng)并使其逐漸獲得發(fā)育能力，兩者之間的雙向通信極其復(fù)雜，需要多個(gè)信號(hào)通路的協(xié)同作用，這種高度的復(fù)雜性使得辨別卵母細(xì)胞后續(xù)的受精和發(fā)育能力異常困難[7]。但研究證實(shí)卵母細(xì)胞一旦從卵泡中脫除，其發(fā)育潛力就會(huì)受到限制，發(fā)育的最大潛力也就被固定了[1]。因此，研究人員通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)液（TCM199）中添加激素、血清、生長(zhǎng)因子、抗氧化劑等物質(zhì)，結(jié)合培養(yǎng)箱特定的環(huán)境條件，盡量模擬體內(nèi)成熟環(huán)境，以達(dá)到最佳的體外成熟效果。

1.2.1 激素

促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是IVM體系中最常見的激素添加劑。補(bǔ)充FSH和LH可以誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟[8]。除此，類固醇激素LH在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟過程中對(duì)減數(shù)分裂的恢復(fù)有重要作用[9]。盡管有研究表明牛COCs的卵丘細(xì)胞能夠在培養(yǎng)體系中分泌雌二醇（E2）和孕酮（P4）[10]，但是牛COCs的IVM體系通常采用微滴培養(yǎng)，即在礦物油覆蓋的培養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行成熟，由于油的高吸收能力，介質(zhì)中E2和P4的濃度會(huì)降低，從而影響COCs的成熟效果[11]。因此，IVM液中也常添加E2以促進(jìn)COCs體外成熟，但添加P4的研究較少。

1.2.2 氣體環(huán)境

O2對(duì)于卵母細(xì)胞順利成熟非常重要，但O2水平較高會(huì)不利于卵母細(xì)胞成熟如活性氧（ROS）的產(chǎn)生，會(huì)損傷卵母細(xì)胞[12]。生理?xiàng)l件下卵泡液中的O2濃度在3%～13%之間，而大多數(shù)牛的IVM方案中使用20%的O2濃度，這相當(dāng)于空氣中的O2濃度。因此，卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的氣體環(huán)境與體內(nèi)條件差別很大。但也有研究報(bào)道，牛IVM期間用5%O2濃度不利于卵母細(xì)胞的成熟[13]。因此，現(xiàn)階段關(guān)于牛卵母細(xì)胞IVM過程中氣體環(huán)境影響的研究，尚未就卵母細(xì)胞成熟的最佳O2濃度得出一致的結(jié)論，需進(jìn)一步研究探索。

1.2.3 抗氧化劑

ROS是配子和胚胎代謝過程中產(chǎn)生的生理副產(chǎn)物，是一種強(qiáng)大的氧化劑，低濃度的ROS在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用，如促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和調(diào)節(jié)植入前胚胎發(fā)育的速率等，然而，ROS濃度過高可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)成分的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生有害影響[14]。

由于ROS存在會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞成熟產(chǎn)生不利影響，許多研究通過向培養(yǎng)液中添加抗氧化物質(zhì)來消除ROS的影響，如褪黑素[15-16]、番茄紅素[17]、半胱氨酸[18]、白藜蘆醇[19]等，能夠有效地降低牛卵母細(xì)胞中ROS含量，提高成熟效果。但也有報(bào)道稱這些物質(zhì)在提高胚胎發(fā)育能力方面差異不顯著[19]，而具體何種抗氧化物質(zhì)在提高胚胎生產(chǎn)效率方面有突出的效果還未見報(bào)道。

1.2.4 血清、生長(zhǎng)因子、糖類物質(zhì)等

研究表明，在體外成熟液中添加10%的胎牛血清（FBS），有助于卵母細(xì)胞成熟及防止透明帶硬化[20]。目前FBS已成為IVM體系中的常規(guī)添加物之一，但進(jìn)口FBS管控嚴(yán)格、價(jià)格昂貴，且FBS中未經(jīng)鑒定的激素可能會(huì)影響培養(yǎng)基批次的一致性，因此，研究人員轉(zhuǎn)向探索無血清的替代培養(yǎng)液，用牛血清純化得到的白蛋白（BSA）作為替代，現(xiàn)已有商業(yè)化的無血清成熟培養(yǎng)基（如日本FHK公司的IVMD101，英國IVF Bioscience公司的BOIVM）被開發(fā)出來。

向IVM培養(yǎng)液中添加表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等能促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟、卵丘細(xì)胞擴(kuò)展[21]。

IVM期間充足的葡萄糖供應(yīng)是卵母細(xì)胞代謝的基本要求。在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可促進(jìn)牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，但I(xiàn)VM期間高濃度的葡萄糖又不利于隨后的胚胎發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)這是由于細(xì)胞內(nèi)ROS升高引起的[22]。當(dāng)IVM期間使用較低的O2濃度培養(yǎng)，同時(shí)使用補(bǔ)充葡萄糖的成熟培養(yǎng)基會(huì)提高最終的囊胚率[23]。因此，葡萄糖可能與O2代謝密切相關(guān)，適量的葡萄糖補(bǔ)充與合適的O2濃度協(xié)同作用才能有助于胚胎發(fā)育。

2 體外受精

2.1 精子來源

通常成熟后的卵母細(xì)胞要與處理好的精子在體外條件下共孵育若干小時(shí)，才能完成體外受精過程，形成的合子中有一半的核物質(zhì)來源于精子。報(bào)道稱精子為胚胎發(fā)育貢獻(xiàn)了用于第一次卵裂的中心粒和一些mRNA[24]，精子功能失調(diào)引起的受精延遲可能是導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化和胚胎發(fā)育缺陷的重要因素[3]。許多研究也表明不同的種公牛，其精子的體外受精能力存在顯著差異[25-26]，可見精子來源也是限制體外胚胎生產(chǎn)效率的重要因素，因此，在以后的生產(chǎn)實(shí)踐中就需要挑選優(yōu)秀的種公牛精液進(jìn)行體外胚胎的生產(chǎn)。

2.2 體外受精液

目前研究中常用的受精體系有兩種，BO液和TALP液，國外也已有商業(yè)化的試劑（如美國MOFA公司的IVF培養(yǎng)基，英國IVF Bioscience公司的BO-IVF培養(yǎng)基）正在推廣使用。牛凍精經(jīng)37℃水浴解凍后，需先用洗滌液處理，目前通用的處理方法是兩次離心法，但不同的受精體系，精液處理時(shí)所用離心力有所不同，離心力過高會(huì)損傷精子，過低會(huì)影響精子的分離效果。BO液和TALP液需要1500r/min，每次5min[27]；而商業(yè)化試劑的受精體系需要328g或400g，離心時(shí)間也不盡相同。因?yàn)殡x心機(jī)的轉(zhuǎn)速與離心力之間的換算關(guān)系與所用離心機(jī)的半徑有關(guān)，所以無法就研究中使用的轉(zhuǎn)速與商品試劑中的離心力相比較，因此，以后的研究中也建議明確精子處理的離心力，以便于后續(xù)類似的研究?jī)?yōu)化改進(jìn)。

在體內(nèi)條件下，精子獲能是精子在受精前必須經(jīng)歷的一個(gè)重要階段，只有經(jīng)過獲能的精子才具有受精能力，因而，在體外也同樣需要此步驟[28]。牛精子體外獲能的方法主要是化學(xué)藥物誘導(dǎo)，向受精液中加入肝素或鈣離子載體，其中肝素對(duì)精子有害影響小，較為常用[29]。BO液處理精子時(shí)還加入了咖啡因，使得精子獲能更快，增強(qiáng)了其獲能效果[6,27]。

不同的受精體系，受精時(shí)間不同，BO液一般為6～8h，TALP液一般為18～24h[30]。但無論何種受精體系，最終受精時(shí)調(diào)整后的精子濃度基本都為100萬～200萬個(gè)/mL。

在體外受精環(huán)節(jié)研究中，成熟后的卵母細(xì)胞一般要去除部分卵丘細(xì)胞，再與精子在受精液中共孵育[31]，而商品化培養(yǎng)液則一般要求保留卵丘細(xì)胞，盡量不要擾動(dòng)擴(kuò)散的卵丘細(xì)胞團(tuán)塊。因此，在去除部分卵丘細(xì)胞以及對(duì)后續(xù)胚胎發(fā)育影響等方面值得去深入研究，得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。

3 體外胚胎培養(yǎng)

3.1 胚胎培養(yǎng)液

目前常用的牛體外胚胎培養(yǎng)液主要有CR1aa和SOF液兩種，這類培養(yǎng)體系要求培養(yǎng)過程中需不斷補(bǔ)充添加血清的新鮮培養(yǎng)液，直至第7d發(fā)育至囊胚階段。而商品化的培養(yǎng)液（如美國MOFA公司的IVC培養(yǎng)基，英國IVF Bioscience公司的BO-IVC培養(yǎng)基）則7d內(nèi)無需補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，大大方便了后期培養(yǎng)。但也有研究表明自配液與商品液的體外胚胎生產(chǎn)效率無顯著差別，但自配液成本要遠(yuǎn)低于商品液，因此更傾向于自配體系的推廣使用[32]。

3.2 共培養(yǎng)

在哺乳動(dòng)物中，胚胎早期發(fā)育是影響成功妊娠的最關(guān)鍵步驟之一，這主要發(fā)生在母體輸卵管內(nèi)，母體輸卵管為配子受精前的準(zhǔn)備、運(yùn)輸、存活、受精和早期胚胎發(fā)育提供了最佳環(huán)境，胚胎—母體之間的有效聯(lián)系對(duì)早期胚胎的成功發(fā)育和存活是必需的[33]。因此，為了更好的模擬體內(nèi)環(huán)境，研究者嘗試在牛體外胚胎培養(yǎng)液中加入一些細(xì)胞，使之與早期胚胎共培養(yǎng)，目前已經(jīng)在自源、異源卵丘細(xì)胞[34]、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）和輸卵管上皮細(xì)胞[35]、馬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和馬羊膜上皮干細(xì)胞[36]等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果可不同程度地提高體外胚胎發(fā)育效率和質(zhì)量。但在操作過程中需要嚴(yán)格控制加入共培養(yǎng)細(xì)胞的濃度，濃度過高，會(huì)過多消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，產(chǎn)生較多的有害代謝產(chǎn)物，對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

3.3 培養(yǎng)環(huán)境

有研究表明胚胎在培養(yǎng)過程中暴露的環(huán)境可能會(huì)影響它們的質(zhì)量和活力[37]。同牛的IVM方案中一樣，牛體外胚胎培養(yǎng)體系也都使用20%的O2濃度，而高O2濃度培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，損傷細(xì)胞的線粒體功能，導(dǎo)致胚胎死亡，因而，培養(yǎng)過程中使用的O2濃度是牛體外胚胎產(chǎn)量的重要決定因素[3]。為此，許多研究者在胚胎培養(yǎng)液中添加抗氧化劑，以阻止ROS對(duì)胚胎的損傷，結(jié)果可顯著提高胚胎的質(zhì)量和產(chǎn)量[38]。但也有研究指出在胚胎培養(yǎng)過程中可以使用低氧培養(yǎng)系統(tǒng)，當(dāng)O2濃度從20%降至5%時(shí)，可觀察到胚胎發(fā)育率明顯增加[37]。而最近的研究表明低氧培養(yǎng)系統(tǒng)適用于無共培養(yǎng)細(xì)胞存在的情況下，共培養(yǎng)條件下仍需用20%的高O2培養(yǎng)系統(tǒng)[35,39]。因此，體外胚胎培養(yǎng)需要根據(jù)使用共培養(yǎng)細(xì)胞與否選擇不同的培養(yǎng)條件。

4 展望

綜上所述，影響牛體外胚胎生產(chǎn)效率的因素有很多，不能過于看重某一方面的因素，需要從體外培養(yǎng)液的成分和培養(yǎng)環(huán)境的整體效應(yīng)來分析。我國的牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)，雖然實(shí)驗(yàn)研究上已接近發(fā)達(dá)國家的水平，不同實(shí)驗(yàn)室都建立有各自的牛體外胚胎生產(chǎn)體系，但在生產(chǎn)實(shí)踐上卻不及一些發(fā)達(dá)國家。因此，以后的研究在注重提高體外胚胎生產(chǎn)效率的同時(shí)，更應(yīng)注重提高體外胚胎移植后的發(fā)育潛力。研究人員可以和胚胎移植實(shí)踐者之間建立合作關(guān)系，進(jìn)行胚胎移植試驗(yàn)，以獲得更有意義的結(jié)論；或可以利用分子生物學(xué)和組學(xué)知識(shí)來確定體內(nèi)、外胚胎在生物學(xué)特征方面的差異，以預(yù)測(cè)體外胚胎移植后存活的可能性。相信在不久的將來，研究者會(huì)很快開發(fā)出更優(yōu)化的牛體外胚胎生產(chǎn)體系，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，加快我國牛良種擴(kuò)繁的進(jìn)程。