屈平平，李 濤，胡士林

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061）

在哺乳動物胚胎發(fā)育早期，如果母體或胚胎受到高溫、放射線、活性氧、重金屬離子、毒性物質(zhì)的侵害，則可能導(dǎo)致胚胎細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損；各種細(xì)胞器的正常功能被破壞，細(xì)胞凋亡增加；胚胎發(fā)育潛能降低、發(fā)育阻滯、死亡。牛2-細(xì)胞期胚胎經(jīng)過熱應(yīng)激處理后，胚胎線粒體腫脹，卵周隙、核周間隙增大，細(xì)胞器從卵胞漿邊緣向中央遷移。強熱應(yīng)激組胞漿和核漿空泡化，蛋白質(zhì)、核內(nèi)染色質(zhì)變性，卵裂球表面絨毛減少，溶酶體增多[1]。妊娠1 d母鼠35℃熱應(yīng)激12 h后，大多數(shù)胚胎在2-細(xì)胞期發(fā)育阻滯，發(fā)育到囊胚的比例僅為24.3%，受精卵的谷胱甘肽含量顯著降低[2]。熱應(yīng)激造成早期胚胎發(fā)育阻滯或死亡的現(xiàn)象在各種家畜均可發(fā)生，且發(fā)生率較高，在人類熱應(yīng)激導(dǎo)致10%～15%的早期流產(chǎn)發(fā)生，其中，30%發(fā)生在囊胚至著床期[3]。

雖然熱應(yīng)激會對胚胎造成一定的損傷，但胚胎能對熱應(yīng)激做出應(yīng)答反應(yīng)，其中，熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）就是應(yīng)答反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一。大量試驗研究表明熱環(huán)境、重金屬（如砷）、缺血、炎癥、乙醇、氨基酸類似物、某些臨床藥物（如水楊酸鈉等）、視黃酸類化合物等100多種應(yīng)激原均可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量HSPs，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整和生理功能正常。HSP70是分子量在68～78 kD之間的一組熱休克蛋白，是HSP家族最為保守的一族。HSPs從受精卵開始即有表達(dá)，結(jié)構(gòu)型的熱休克蛋白70（HSC70）是著床前最主要表達(dá)的蛋白。在正常生理條件下，HSC70主要以“分子伴娘”的形式介導(dǎo)其他蛋白正確折疊、組裝和分布，參與細(xì)胞正常的生長、發(fā)育和分化。應(yīng)激時產(chǎn)生的誘導(dǎo)型熱休克蛋白70（HSP70）在囊胚時開始表達(dá)，通過分子伴侶作用，增加細(xì)胞熱耐受性，抑制細(xì)胞凋亡等途徑保護(hù)胚胎免受應(yīng)激引起的損傷，保證胚胎正常發(fā)育。

近幾十年來，人們以母體應(yīng)激和體外胚胎培養(yǎng)為試驗?zāi)Ｐ?，利用免疫?xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫印記、核酸分子雜交、RT-PCR和單、雙向電泳等分子生物學(xué)技術(shù)，從發(fā)育學(xué)的角度探討了HSP70與胚胎生長發(fā)育和畸形發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系，并取得大量成果。從國內(nèi)外的研究趨勢上看，HSP70將是今后若干年胚胎發(fā)育和致畸領(lǐng)域研究的主要內(nèi)容之一。

1 HSP70的特性

HSP70為熱休克蛋白家族中最為重要、最保守、含量最多的一族，包括68、72、73、75、78 KD等共有21種蛋白質(zhì)，他們具有相同的酸性等電點和相似的胰蛋白酶肽譜，具有“卷線樣”構(gòu)象段。熱休克蛋白70按照其產(chǎn)生的方式可分為結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白70（HSC70）和誘導(dǎo)型熱休克蛋白70（HSP70）2種，二者統(tǒng)稱為HSP70。兩種熱休克蛋白70的氨基酸序列具有90%的同源性，功能也十分相似；但是HSC70和HSP70mRNA表達(dá)在時間和空間上有所不同，表達(dá)閾值也不同[4]。HSP70具高度的同源性和普遍性，HSP70幾乎存在于所有動物的各種組織細(xì)胞中，而且不同HSP70 N端2/3部分較C端1/3部分保守的多。正常情況下HSP70在細(xì)胞內(nèi)呈基礎(chǔ)表達(dá)，表達(dá)水平較低，以可溶性的形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞遭受應(yīng)激，HSP70快速、顯著的合成，一般數(shù)分鐘即可達(dá)到最高水平，這是因為HSP70基因不含有內(nèi)含子，mRNA加工及時，轉(zhuǎn)錄快速；在應(yīng)激條件下，除HSPmRNA以外的mRNA都處于非翻譯狀態(tài)，HSPmRNA的翻譯競爭減少。應(yīng)激時HSP70以高濃度集聚在染色體和核質(zhì)內(nèi)，作為瞬間的細(xì)胞基質(zhì)和核基質(zhì)固定細(xì)胞，防止染色質(zhì)和mRNA復(fù)合物降解[5]。而應(yīng)激消除后細(xì)胞處于恢復(fù)階段時，細(xì)胞核內(nèi)的HSP70又返回胞漿，并且在細(xì)胞漿內(nèi)呈低水平表達(dá)，再次應(yīng)激又重新返回細(xì)胞核。

2 早期胚胎中HSP70家族的基因類型和表達(dá)規(guī)律

HSP70由HSP70基因家族HSP70-1、HSP70-2、HSP70-Horn、 HSP70B、 HSP70B'、 HSC70、 GRP78、PBP74、SICTH等編碼[6]。HSP70-l和HSP70-2基因的核苷酸有l(wèi)1處差異，2處位于編碼區(qū)，HSP70-1基因為熱誘導(dǎo)表達(dá)，在無熱誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞中有低水平表達(dá)。HSP70-2僅限于熱休克狀態(tài)表達(dá)，HSP70B基因和HSP70B'基因，為嚴(yán)格熱誘導(dǎo)表達(dá)，無基礎(chǔ)表達(dá)。PBP74可以與抗HSP70蛋白抗體結(jié)合。熱休克蛋白70主要被熱休克因子控制，亦與C2fos、C2myc、p53等基因及鈣/鈣調(diào)蛋白、甘油二酯、磷酸肌醇23激酶、cAMP、PKC等生理因子有關(guān)[7]。

胚胎發(fā)育中合子基因組激活后，熱休克基因最先表達(dá)，且具有階段特異性和組織特異性。結(jié)構(gòu)型HSP70在植入前各期小鼠胚胎中均有表達(dá)。誘導(dǎo)型的HSP70在胚胎發(fā)育到8-cell期時才能檢測到[8]。HSP68和HSP70在2-細(xì)胞期的小鼠胚胎自發(fā)表達(dá)，但HSP68的自發(fā)表是暫時的，4-cell期即停止，囊胚期后（含囊胚期）HSP68才能被誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)構(gòu)型HSC73通常在神經(jīng)管閉合、神經(jīng)外胚層分化和增殖過程中有較高水平的表達(dá)，位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，參與神經(jīng)元的分化。結(jié)構(gòu)型GRP75和GRP78在胚胎發(fā)育階段也有表達(dá)，其中，GRP75定位于小鼠18號染色體[9]。

Christians等[8]證實早在受精卵的單細(xì)胞階段即有HSP70-1mRNA的構(gòu)成型表達(dá)，在兩個細(xì)胞階段達(dá)高峰，之后表達(dá)減少，直到在胚囊階段成為熱誘導(dǎo)型HSP70-1。誘導(dǎo)型、構(gòu)成型HSP70-2 mRNA在小鼠胚胎中均無表達(dá)。在人類的胚胎形成中除了誘導(dǎo)型的HSP70-2/1還有另外1對誘導(dǎo)型的HSP70，即HSP70-6和HSP70-7，他們的序列具有95%的同源性。

3 HSP70對早期胚胎的保護(hù)作用

Al-Katanani等[10]在2-細(xì)胞牛胚的培養(yǎng)液里加入誘導(dǎo)型的HSP70抗體后發(fā)現(xiàn)2-細(xì)胞牛胚發(fā)育到囊胚的百分率降低。Neuer等[11]用抗鼠HSP70單克隆抗體與2-細(xì)胞鼠胚共同孵育，在第5天時發(fā)現(xiàn)囊胚孵出率明顯降低，結(jié)果說明，抗HSP70抗體對鼠胚生長產(chǎn)生強抑制作用。Mirkes等[12]發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)誘導(dǎo)型HSP70的轉(zhuǎn)基因小鼠可以防御由高熱引起的胚胎致死效應(yīng)。還有很多類似的試驗證明HSP70對胚胎發(fā)育具有保護(hù)作用，可能是與HSP70的特殊生物功能有關(guān)。

3.1 HHSSPP7700的分子伴侶作用 在生理條件下，HSP70做為分子伴侶，直接參與蛋白質(zhì)從初生鏈合成到多亞基復(fù)合體折疊、裝配的整個生物合成，并參與蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的易位、參與分解錯裝的蛋白等，對調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。哺乳動物胚胎在應(yīng)激條件下誘導(dǎo)合成大量的HSP70，而其他蛋白的合成暫時停止或減弱。新合成的HSP70通過在胞質(zhì)中識別和結(jié)合某些未折疊的多肽鏈，阻止其不可逆的變性和聚集，同時還促進(jìn)變性蛋白質(zhì)的降解和清除，重新激活某些酶以維護(hù)細(xì)胞的功能和生存。應(yīng)激停止后，HSP70通過ATP供能幫助折疊錯誤的蛋白質(zhì)解開，促進(jìn)其正確折疊和裝配。

3.2 HHSSPP7700參與細(xì)胞增殖 HSC70位于星體、紡錘體及中心體等有絲分裂裝置，在細(xì)胞有絲分裂過程中起一定的作用。向雞胚中加入微量抗HSP70的抗體，隨抗體濃度的增加，可破壞有絲分裂裝置，阻斷細(xì)胞分裂，干擾細(xì)胞分化[13]。在應(yīng)激情況下，HSPs可作為細(xì)胞周期抑制分子的穩(wěn)定劑或細(xì)胞周期促進(jìn)分子的抑制劑對細(xì)胞周期產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控[14]。熱休克蛋白70抗體還能降低精子穿過卵母細(xì)胞透明帶的能力，干擾受精卵Ⅱ期減數(shù)分裂和原核的形成。因此，人們利用HSP70的這種特性，研究HSP70在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用，并取得了一定的成果。

3.3 HHSSPP7700與耐熱性 將重組誘導(dǎo)型HSP70基因轉(zhuǎn)入鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)增加，成纖維細(xì)胞對熱的抗性增加[15]。Browder比較不同發(fā)育階段海膽胚胎熱休克后的發(fā)育狀況，結(jié)果從受精卵到囊胚胎期間的任何階段都未發(fā)現(xiàn)HSP的誘導(dǎo)合成，此期胚胎死亡及異常達(dá)99%，但當(dāng)囊胚期及其以后，熱應(yīng)激可以誘導(dǎo)HSP合成，胚胎成活及正常發(fā)育率達(dá)99%以上[16]。轉(zhuǎn)基因小鼠耐熱性增強，且耐熱性的水平與HSP70的表達(dá)水平密切相關(guān)。說明HSP70能夠增加胚胎對熱應(yīng)激的耐受性，因此，將胚胎在溫和熱環(huán)境下進(jìn)行熱休克處理后，可以抵抗更大強度的熱應(yīng)激，提高胚胎在各種熱環(huán)境下得存活率。

3.4 抑制細(xì)胞凋亡 已知許多應(yīng)激原通過激活凋亡途徑從而導(dǎo)致胚胚發(fā)育異常，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)HSP70水平增高可以通過阻斷信號通路，抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的JNK激活，從而減少細(xì)胞的凋亡[17]。向培養(yǎng)液中加入熱休克蛋白70抗體后，體外培養(yǎng)的胚胎細(xì)胞凋亡增多，囊胚率明顯降低，HSP70還能抑制應(yīng)激激酶P38的活性。所以，在應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)HSP70家族基因表達(dá)增加，可抑制應(yīng)激激酶激活，防止細(xì)胞凋亡。HSP72還可通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，或直接與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C結(jié)合，從而阻止caspase的激活，抑制細(xì)胞凋亡[18]。HSP70還能抑制氧自由基的產(chǎn)生，直接釋放和增加內(nèi)源性過氧化酶水平，清除氧自由基，減少Ca2+內(nèi)流所引起的細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡[19]。

4 目前研究早期胚胎中HSP70的常用方法

4.1 誘導(dǎo)胚胎產(chǎn)生HHSSPP7700的方法 最常用的方法是熱應(yīng)激。

4.1.1 按照熱應(yīng)激的次數(shù)分 可分為連續(xù)熱應(yīng)激和單次熱應(yīng)激。連續(xù)熱應(yīng)激即每天在固定時間對數(shù)批孕鼠或胚胎（體外）進(jìn)行不同溫度梯度的熱休克處理，連續(xù)處理數(shù)次，直至預(yù)定時間（1-cell期、2-cell期、4-cell期、8-cell期、桑椹胚、囊胚）。然后處死小鼠，取出胚胎，繼續(xù)體外培養(yǎng)或直接對胚胎進(jìn)行處理。單次熱應(yīng)激即在胚胎發(fā)育的不同階段，對孕鼠或胚胎（體外）進(jìn)行一次熱休克處理，然后再恢復(fù)至正常條件下，待胚胎繼續(xù)發(fā)育一段時間，再對胚胎進(jìn)行處理[20-23]。

4.1.2 按照熱應(yīng)激的對象分 可分為體外熱應(yīng)激和體內(nèi)熱應(yīng)激。體內(nèi)熱應(yīng)激是對母鼠進(jìn)行熱休克處理（一般是把小鼠放在生化培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置預(yù)定溫度，熱休克處理一段時間），再將小鼠處死，取出胚胎，進(jìn)行檢測；或?qū)π凼筮M(jìn)行一定時間的熱應(yīng)激后與正常雌鼠交配，檢測胚胎的發(fā)育情況。體外熱應(yīng)激是將發(fā)育到一定階段的胚胎取出，培養(yǎng)一段時間后，將CO2培養(yǎng)箱溫度調(diào)至一定溫度，熱休克處理一段時間，再恢復(fù)至正常或取出胚胎后直接對胚胎進(jìn)行熱應(yīng)激處理。

4.2 胚胎中HHSSPP7700定性、定量和定位檢測 根據(jù)熱休克蛋白70家族具有相似的等電點，在pH梯度膠中等電聚焦將其分離，然后按照熱休克蛋白70家族成員的分子量大小在垂直方向或水平方向進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳第二次分離，凝膠經(jīng)圖像掃描后，用Image Master圖像軟件系統(tǒng)分析[24]。核酸雜交技術(shù)可以證明HSP70基因是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細(xì)胞或組織中存在的部位[25-26]。原位雜交細(xì)胞或組織化學(xué)技術(shù)，用特殊標(biāo)記（放射性同位素標(biāo)記物或非放射性的標(biāo)記物）核酸探針（DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等），進(jìn)行了細(xì)胞或組織的基因定位[27]。RT-PCR比Northern印跡或核酸酶保護(hù)分析更靈敏，需要的RNA量及序列信息較少，而且還可以對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，用于Southern雜交和原位雜交，質(zhì)粒重組，基因轉(zhuǎn)染等后續(xù)試驗[28]。這種方法常用于在胚胎中HSP70的研究。

5 HSP70的研究意義

在早期胚胎發(fā)育時期，細(xì)胞的增殖和分化旺盛，基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成非?；钴S，在這個時期，研究胚胎中HSP變化和作用，是探討HSP70與胚胎生長發(fā)育和畸形發(fā)生內(nèi)在聯(lián)系的重要途徑。分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，為從分子水平方面揭示胚胎發(fā)育正常/異常的奧秘開辟一條新的途徑。

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