劉艷紅，張 驥，余孝其，李 靜，王 娜

(1.四川大學(xué) 基礎(chǔ)化學(xué)實驗教學(xué)中心，四川 成都 610064；2.四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064)

化學(xué)生物學(xué)是19世紀(jì)中期興起的交叉性、實驗性學(xué)科。它的出現(xiàn)開拓了現(xiàn)代化學(xué)的研究領(lǐng)域，為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等傳統(tǒng)學(xué)科的發(fā)展帶來了新的機遇。在我國，發(fā)展化學(xué)生物學(xué)已經(jīng)成為國家發(fā)展的重要戰(zhàn)略[1]。為了適應(yīng)學(xué)科的發(fā)展，國內(nèi)多所高校相繼設(shè)立了化學(xué)生物學(xué)研究方向，其中部分高校還創(chuàng)辦了化學(xué)生物學(xué)本科專業(yè)。在本科教學(xué)階段，化學(xué)生物學(xué)理論課程體系已逐步完善，但實驗課程建設(shè)卻嚴(yán)重滯后，缺少普遍適用的化學(xué)生物學(xué)實驗教材[2]。如何結(jié)合學(xué)科前沿，加快實驗項目開發(fā)，完善化學(xué)生物學(xué)實驗教材是建設(shè)高?；瘜W(xué)生物學(xué)實驗課程體系亟待解決的問題。

本實驗結(jié)合化學(xué)生物學(xué)研究前沿，針對本科三年級學(xué)生，設(shè)計了一個綜合創(chuàng)新實驗：將3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)引入本科實驗教學(xué)，通過聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)熒光標(biāo)記基因和綠色熒光蛋白報告基因的轉(zhuǎn)染，觀察基因在3D細(xì)胞模型中的傳輸及表達(dá)情況。該實驗將3D細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和激光掃描共聚焦顯微鏡三維重構(gòu)等先進(jìn)的實驗技術(shù)和現(xiàn)代化分析方法有機地融合起來，形成了一個內(nèi)容新穎、技術(shù)先進(jìn)的綜合創(chuàng)新實驗，旨在向?qū)W生介紹最新的實驗技術(shù)和分析方法，提高學(xué)生實踐探索和分析解決問題的能力，為今后參與科研項目或從事相關(guān)領(lǐng)域的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 實驗?zāi)康?/h3>

學(xué)習(xí)并掌握3D細(xì)胞的培養(yǎng)方法；了解PEI與質(zhì)粒DNA的復(fù)合方法；了解基于3D細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)染方法；基本掌握激光掃描共聚焦的原理和使用方法；提高學(xué)生查閱文獻(xiàn)、設(shè)計實驗方案的能力；加強學(xué)生對化學(xué)生物學(xué)先進(jìn)實驗技術(shù)、研究方法的認(rèn)知。

1.2 實驗原理

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞并使其獲得特定遺傳標(biāo)志的過程[3]。傳統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗是以單層細(xì)胞(2D細(xì)胞)作為研究模型。最新研究發(fā)現(xiàn)，由于2D細(xì)胞所表現(xiàn)的生物學(xué)特性，如細(xì)胞的形態(tài)、功能、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用等[4]與體內(nèi)細(xì)胞存在較大差異[5]，在研究中經(jīng)常會出現(xiàn)體內(nèi)外結(jié)果無法相互支持的情況。因此，構(gòu)建一種更接近于體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境的體外細(xì)胞模型是十分必要的。與2D細(xì)胞不同，3D細(xì)胞模型中細(xì)胞生長的微環(huán)境幾乎接近于體內(nèi)，可以真實地反映體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用[6-7]，在一定程度上重現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的過程[8]。目前，3D細(xì)胞模型已經(jīng)成為化學(xué)生物學(xué)學(xué)科前沿中最重要的體外研究模型[9-10]。本實驗將3D細(xì)胞模型引入本科教學(xué)實驗，對傳統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗重新設(shè)計、改造，形成了一個內(nèi)容充實、技術(shù)先進(jìn)的綜合創(chuàng)新實驗。

PEI是一種聚陽離子載體材料，在3D細(xì)胞模型中具有良好的基因轉(zhuǎn)染效率。聚乙烯亞胺含有多級胺的結(jié)構(gòu)，分子表面帶有較強的正電荷，在溶液中可以與帶負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA通過分子間靜電作用相結(jié)合，形成納米尺寸的復(fù)合物[11]。該復(fù)合物與細(xì)胞膜表面接觸，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源基因?qū)爰?xì)胞[12-13]。

1.3 實驗試劑和儀器

1.3.1實驗試劑

甲基纖維素，美國Amresco公司；瓊脂糖、DMEM培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清，美國賽默飛世爾科技公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.3.2實驗儀器

TS-100型倒置顯微鏡，日本尼康公司；LSM780共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司等。

1.4 實驗方法

1.4.13D細(xì)胞培養(yǎng)

首先，將Hela細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，并計數(shù)。然后，用含0.24%甲基纖維素的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸液稀釋至1×105個/mL，并在混合均勻后將其滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上，每滴為25μL，將內(nèi)蓋反扣蓋好后放置于溫度為37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，將內(nèi)蓋上已形成的多細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至瓊脂糖(質(zhì)量體積比為1%)預(yù)包被的96孔板中，每孔一個細(xì)胞團(tuán)，單孔加入100μL完全培養(yǎng)基。最后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，備用[14]。

1.4.2Cy5標(biāo)記質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染實驗

多細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)72h后用于基因轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染方法包括：

1)PEI與Cy5標(biāo)記質(zhì)粒DNA復(fù)合。復(fù)合步驟為：PEI和質(zhì)粒分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至50μL；然后將稀釋后的質(zhì)粒滴加至PEI中，室溫下輕輕混勻復(fù)合30min(復(fù)合質(zhì)量比為10，DNA用量為0.8μg/孔)，備用。

2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟為：實驗前，吸去96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，并加入50μL無血清培養(yǎng)基，將PEI/DNA復(fù)合物滴加至96孔板中；培養(yǎng)4h后，吸去無血清培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基(100μL/孔)，將96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20h；然后在共聚焦掃描顯微鏡下觀察熒光信號的分布情況，隨機選取3～6個視野拍照。

重復(fù)實驗三次。

1.4.3報告基因的轉(zhuǎn)染實驗

報告基因增強綠色熒光蛋白(EGFP)的轉(zhuǎn)染方法同1.4.2節(jié)步驟：將PEI與pEGFP質(zhì)粒在室溫下復(fù)合30min(復(fù)合質(zhì)粒比為10，DNA用量為0.8μg/孔)；然后滴加至96孔板中，培養(yǎng)4h后，更換新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h；利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在3D細(xì)胞模型中的分布情況，隨機選取3～6個視野拍照。重復(fù)實驗三次。

1.4.4觀察與拍照

利用激光掃描共聚焦顯微鏡對3D細(xì)胞球做多層光學(xué)切片掃描后再進(jìn)行三維重構(gòu)，觀察基因在3D細(xì)胞模型中的傳輸及表達(dá)情況。其中，Cy5的激發(fā)波長為633nm，最大發(fā)射波長為670nm；綠色熒光蛋白的激發(fā)波長為488nm，最大發(fā)射波長為507nm。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 建立3D細(xì)胞培養(yǎng)模型

3D細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板后，分別于24h、48h和72h時，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，實驗結(jié)果如圖1所示。其中，物鏡放大倍數(shù)為4，圖中標(biāo)尺的長度代表100μm。培養(yǎng)24h時，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象，形成多細(xì)胞團(tuán)。此時，細(xì)胞呈圓形，大小均一，細(xì)胞與細(xì)胞間彼此接觸，形成松散的細(xì)胞球，球體直徑約為500μm(如圖1(a)所示)。培養(yǎng)48h后，細(xì)胞球的直徑未見明顯變化，但是細(xì)胞層增厚，邊緣更加光滑，形成了大小均一、結(jié)構(gòu)致密的3D細(xì)胞球(如圖1(b)所示)。如圖1(c)所示為72h時觀察到的細(xì)胞形態(tài)，3D細(xì)胞球的直徑增加，細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸更加緊密，結(jié)構(gòu)更加致密，此時可用于轉(zhuǎn)染實驗。

圖1 培養(yǎng)時間對3D細(xì)胞球形態(tài)的影響

2.2 Cy5標(biāo)記基因在3D細(xì)胞模型中的傳輸

為了考察基因在3D細(xì)胞中的傳輸情況，實驗將熒光染料Cy5標(biāo)記的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染實驗，并采用激光掃描共聚焦成像的方法進(jìn)行觀察，得到如圖2所示的結(jié)果。其中，物鏡放大倍數(shù)為10，圖中標(biāo)尺的長度代表5μm。Cy5標(biāo)記質(zhì)粒在圖中顯示為紅色熒光，如圖2所示，可觀察到大量的紅色熒光，且強度較強，PEI在3D細(xì)胞模型中表現(xiàn)出良好的DNA傳輸能力。三維重構(gòu)(3D)效果圖顯示有大量的DNAcy5存在于3D細(xì)胞球內(nèi)層細(xì)胞中。

圖2 Cy5標(biāo)記DNA在3D細(xì)胞模型中的傳輸情況

2.3 增強綠色熒光蛋白在3D細(xì)胞模型中的表達(dá)

為了考察PEI介導(dǎo)綠色熒光蛋白報告基因在3D細(xì)胞模型中的表達(dá)情況，實驗將質(zhì)粒pEGFP用于轉(zhuǎn)染實驗，實驗結(jié)果如圖3所示(物鏡放大倍數(shù)為10，圖中標(biāo)尺的長度代表5μm)。結(jié)果顯示：3D細(xì)胞模型中有零星綠色熒光分布，表明在該質(zhì)量比時，PEI介導(dǎo)的報告基因在3D細(xì)胞模型中有一定的表達(dá)，但表達(dá)效率較低。在后續(xù)教學(xué)實驗中可以增加轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的設(shè)計。

圖3 綠色熒光蛋白在3D細(xì)胞模型中的表達(dá)

3 實驗結(jié)論

本實驗改變基于單層細(xì)胞的轉(zhuǎn)染模型，建立了3D細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系。在質(zhì)量比為10時，PEI介導(dǎo)的外源基因在3D細(xì)胞模型中具有良好的傳輸能力和一定的表達(dá)能力。

4 教學(xué)模式設(shè)計和討論

1)將創(chuàng)新型設(shè)計實驗的實施與開放式實驗管理相結(jié)合。本實驗包含了3D細(xì)胞模型的構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)染、基因傳輸及表達(dá)結(jié)果檢測等內(nèi)容，所需教學(xué)時間長。在教學(xué)過程中，可以靈活調(diào)整實驗室管理方法，在不影響本科實驗教學(xué)的前提下，采用開放式管理模式，每個小組的學(xué)生根據(jù)實驗進(jìn)度來安排實驗時間，確保每位同學(xué)都可以完成全部的實驗操作。

2)規(guī)范實驗操作，提高實驗成功率。例如，3D細(xì)胞培養(yǎng)實驗中，多細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至孔板時，需要注意移液器插入孔板的方向和吸取的力度，避免多細(xì)胞團(tuán)被吹散。因此，在進(jìn)行該實驗教學(xué)時，需要提前指出實驗操作的要點，并針對關(guān)鍵性步驟進(jìn)行操作示范，提高實驗的成功率。

3)利用多媒體教學(xué)，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。例如：采用多媒體技術(shù)將3D細(xì)胞培養(yǎng)模型的發(fā)展過程和技術(shù)要點以圖片和視頻的方式展示給學(xué)生，通過強烈的感觀刺激激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣。

5 結(jié)束語

將先進(jìn)的實驗技術(shù)和現(xiàn)代化分析方法引入本科教學(xué)，不斷充實實驗教學(xué)內(nèi)容是四川大學(xué)實驗課程教學(xué)改革的基本思路?！盎?D細(xì)胞模型的基因轉(zhuǎn)染”綜合創(chuàng)新實驗的設(shè)計是化學(xué)生物學(xué)實驗教學(xué)改革的一次重要嘗試，也是化學(xué)生物學(xué)實驗課程建設(shè)的試金石。而這種將先進(jìn)的實驗技術(shù)和現(xiàn)代化分析方法轉(zhuǎn)化為本科實驗教學(xué)內(nèi)容，實現(xiàn)科研與教學(xué)相互支持、相互轉(zhuǎn)化的模式也必將成為四川大學(xué)化學(xué)生物學(xué)實驗項目開發(fā)的特色。