章榮葉，羅成江，湯賽飛，王彬，陳曉林，林仙軍

（1.臺(tái)州市屠宰管理所 浙江臺(tái)州318000；2.浙江省獸藥飼料監(jiān)察所 杭州 311101；3.浙江建安檢測(cè)研究院有限公司 杭州 310006）

雙黃連注射液由金銀花、黃芩和連翹三味中藥材制成，主要含有綠原酸、黃芩苷和連翹苷等有效成分[1]。獸醫(yī)臨床用于預(yù)防和治療畜禽外感風(fēng)寒所致的上呼吸道感染[2]、急性支氣管炎[3]、急性扁桃腺炎[4]和輕型肺炎等[5]。目前，該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版（中藥卷）[6]。標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜法鑒別綠原酸、黃芩苷和連翹，采用HPLC法測(cè)定黃芩苷的含量，未對(duì)連翹苷進(jìn)行質(zhì)量控制。目前，連翹苷含量測(cè)定的高效液相色譜方法主要有熒光檢測(cè)法[7]和紫外法[8-11]。因此，本文對(duì)連翹苷檢測(cè)的兩種方法進(jìn)行了比較研究，然后利用建立的方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)，為完善雙黃連注射液的質(zhì)量控制積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

連翹苷對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110821-201213，含量95.3%；雙黃連注射液，規(guī)格為10mL，批號(hào)為 20180801、20180802、20180803等3批。乙腈、甲醇均為色譜純，德國(guó)默克公司；磷酸、三乙胺和磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水。

Agilent 1260高效液相色譜儀，配VWD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Waters 2695-2475高效液相色譜儀（配Empower 2軟件）；梅特勒-托利多METTLER TOLEDO XS-205電子天平（精度為0.01mg）。

1.2 高效液相色譜-熒光法

1.2.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的配制 取連翹苷對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液配制成每1mL中含連翹苷約1μg/mL的溶液，為連翹苷對(duì)照品溶液；取雙黃連注射液1.00mL，于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋?zhuān)ㄈ?；再取該溶?.00mL，于50mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋?zhuān)ㄈ?，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.2.2 液相色譜參考條件 色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；熒光檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)277nm，發(fā)射波長(zhǎng)315nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75，v∶v）。

1.3 高效液相色譜-紫外法

1.3.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的配制 取連翹苷對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液配制成每1mL中含連翹苷約100μg/mL的溶液，為連翹苷對(duì)照品溶液；取雙黃連注射液1.00mL，于5mL量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋?zhuān)ㄈ?，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

圖1 對(duì)照品溶液（濃度為1μg/mL）色譜圖（熒光檢測(cè)器）

圖2 供試品溶液（批號(hào)為20180101）色譜圖（熒光檢測(cè)器）

圖3 對(duì)照品溶液（濃度為1 μg/mL）色譜圖(紫外檢測(cè)器）

1.3.2 液相色譜參考條件 色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)278nm，柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為20μL；流動(dòng)相：乙腈-水（25∶75，v∶v）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光檢測(cè)條件的確定

熒光檢測(cè)條件的確定及掃描方法參考文獻(xiàn)[12]，首先將儀器的激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為200nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為210~800nm，掃描后發(fā)現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)在277nm處有最大吸收；因此，將277nm的波長(zhǎng)作為發(fā)射波長(zhǎng)固定下來(lái)，做激發(fā)波長(zhǎng)的掃描，掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)激發(fā)波長(zhǎng)在315nm處有最大吸收。因此確定熒光檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)277nm、發(fā)射波長(zhǎng)315nm。

2.2 色譜柱的選擇

分別對(duì)Waters Symmetry C18、Waters Atlantis C18和Agilent ZORBAX Extend-C18等三種色譜柱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果這三種色譜柱都可以用于連翹苷的檢測(cè)。

2.3 流動(dòng)相的選擇

比較了磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸溶液-乙腈和水-乙腈體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水-乙腈流動(dòng)相體系連翹苷峰型最好、靈敏度最高。優(yōu)化配比，使連翹苷獲得最佳保留時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為乙腈-水（25∶75，v∶v），流速為1.0mL/min。

2.4 線(xiàn)性考察、檢測(cè)限和定量限

取標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積Y對(duì)濃度X（μg/mL）作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。熒光檢測(cè)法得出回歸方程為Y＝6.72×105X-2.36×104， 相 關(guān) 系 數(shù) R2為0.9999， 在 0.01~10.0μg/mL 的濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系；紫外檢測(cè)法得出回歸方程為Y＝3.66×105X+1.06×104，相關(guān)系數(shù)R2為 0.9999， 在 1~200μg/mL 的濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表1 兩種方法測(cè)定雙黃連注射液中連翹苷含量結(jié)果比較（n=3）

圖4 供試品溶液（批號(hào)為20180101）色譜圖（紫外檢測(cè)器）

2.5 高效液相色譜結(jié)果分析

按照上述方法測(cè)定，典型色譜圖見(jiàn)圖1-4。

2.6 兩種方法結(jié)果比較

對(duì)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法和高效液相色譜-紫外檢測(cè)法的結(jié)果進(jìn)行比較，每批3次測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3.0%以?xún)?nèi)，兩種方法含量測(cè)定平均值的相對(duì)偏差在3.0%以?xún)?nèi)，表明結(jié)果無(wú)顯著差異。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，熒光法和紫外法測(cè)定雙黃連注射液中連翹苷的含量，結(jié)果無(wú)顯著差異，兩種方法都可以用于連翹苷的測(cè)定，熒光檢測(cè)法響應(yīng)較高，不易受雜質(zhì)干擾，對(duì)于低含量、雜質(zhì)較多的樣品，影響因素較少，抗干擾強(qiáng)；紫外法響應(yīng)低，易受雜質(zhì)干擾，誤差較大?！?/p>