方小霞， 周 易， 孫高林， 邱一華， 彭聿平△

(1. 南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系， 2. 機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南通 226001)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種進(jìn)行性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)( central nervous system，CNS)退行性疾病。其主要的病理組織學(xué)改變?yōu)椋荷窠?jīng)元外淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide, Aβ) 集聚形成的老年斑(senile plaques，SP)，皮層和海馬膽堿能神經(jīng)元及其突觸的大量丟失，神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白的異常集聚形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)[1]。近年來對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)可能是其重要的病理特征之一。小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS固有的免疫細(xì)胞，在健康的腦中小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為靜止的表型，但在腦損傷后會(huì)變得高度活躍，產(chǎn)生活性氧，NO和促炎細(xì)胞因子，因此，小膠質(zhì)細(xì)胞在病理性損傷的監(jiān)測(cè)和反應(yīng)中起著重要作用[2]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，這可能有助于神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展[3]。例如，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞及其分泌的因子，如TNF-α，是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，這已被證明與神經(jīng)退行性疾病如AD相關(guān)[4, 5]。聚集的Aβ具有十分強(qiáng)大的毒性作用，能夠引起小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖并產(chǎn)生致炎因子, 引發(fā)神經(jīng)炎癥。而炎癥反應(yīng)又能促進(jìn)Aβ的沉積，加重炎性斑的形成, 形成惡性循環(huán)，最后導(dǎo)致 AD 的發(fā)生[6]。因此, 小膠質(zhì)細(xì)胞及其相關(guān)的炎癥反應(yīng)在 AD 的形成過程中發(fā)揮著重要的作用。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 是一種免疫抑制因子，是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和損傷后組織修復(fù)的重要調(diào)節(jié)因子。TGF-β1的分布較為廣泛，遍及全身各大組織系統(tǒng)，在正常狀態(tài)下，CNS 中TGF-β1的含量較少,但在一些病理情況下，如炎癥、腫瘤、腦積水等CNS疾病中，TGF-β1的含量會(huì)明顯增加，說明TGF-β1與CNS中的某些疾病關(guān)系密切。多種類型的損傷均可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞能分泌TGF-β1，然而TGF-β1也能夠阻止小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，并且可選擇性的誘導(dǎo)其凋亡，表現(xiàn)出TGF-β1的抗炎作用[7]。在CNS炎癥反應(yīng)的急性期，促炎因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞侵襲和膠質(zhì)細(xì)胞增生，然而在炎癥反應(yīng)的慢性期，TGF-β1可能具有抑制這些細(xì)胞功能的作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)室先前研究[9]發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的損傷作用比單獨(dú)神經(jīng)元培養(yǎng)體系更明顯，提示小膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)炎癥對(duì)神經(jīng)元損傷的促進(jìn)作用，因此本研究選用海馬神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探討TGF-β1對(duì) Aβ1-42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活釋放細(xì)胞因子的影響，為TGF-β1抑制Aβ毒性的具體作用機(jī)制做進(jìn)一步的探究。

1 材料與方法

1.1 Aβ1-42寡聚體的制備

Aβ1-421 mg溶于220 μl冷卻的六氟異丙醇 (HFIP) 中，制成 1 mmol/L溶液，室溫孵育 60 min，將 Aβ 肽-HFIP放置在冰上 5 min，移至通風(fēng)櫥風(fēng)干后形成Aβ 肽膜，將其溶解于 44 μl二甲基亞礬 (DMSO)，制成 5 mmol /L Aβ1-42合成肽，再用無酚紅的 F12 培養(yǎng)液將其稀釋成100 μmol /L，4℃ 孵育 24 h 后，4℃、15 000 r/min 離心10 min，上清液即為Aβ1-42寡聚體，分裝后置于 - 20 °C 冰箱保存。

1.2 大鼠海馬神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)

取孕18 d SD大鼠(由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，麻醉后剖腹取胚胎置D-hanks液中。分離海馬組織，0.125%胰酶37℃水浴消化15 min。含10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，計(jì)數(shù)、按1×106/cm2細(xì)胞接種至多聚賴氨酸預(yù)先包被的培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 h后換Neurobasal/B27培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后加入純化的小膠質(zhì)細(xì)胞，海馬神經(jīng)元小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)8 d。取出生0～1 d的SD大鼠全腦，經(jīng)消化、終止消化后，將細(xì)胞按5×105/cm2細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)11 d后運(yùn)用搖床振搖法分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞[10]，即37℃恒溫?fù)u床上以240 r/min搖2 h后, 收集懸浮的細(xì)胞即小膠質(zhì)細(xì)胞，此法獲得小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)CD11b染色鑒定純度可達(dá)95%以上。將純化后的小膠質(zhì)細(xì)胞種于已培養(yǎng)4 d的海馬神經(jīng)元中，此為神經(jīng)元小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)的第0日，神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)8 d。

1.3 藥物處理

在海馬神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)的第5日，加入TGF-β1(5 or 20 ng/ml), 1 h 后加入Aβ1-42(5 μmol/L)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，于第8日后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 Real time PCR

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體積為20 μl，含cDNA 模板2 μl，上、下游引物各0.3 μl，Taq 酶0.1 μl、dNTPmix 10 μl、SYBR Green 0.4 μl，雙蒸水補(bǔ)齊(表1)。PCR 反應(yīng)條件為初始程序95℃，5 min；40個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)在ABI 7500 real Time PCR儀上進(jìn)行，采用β-actin作為內(nèi)參。以Rotor-Gene 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。軟件分析其Ct值及相對(duì)值(relative quantity, RQ)，RQ=2-ΔΔCt，計(jì)算各細(xì)胞因子mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Western blot

Tab. 1 Sequences of PCR primers

用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，Bio-Rad濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜200 mA、60 min-2 h，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗iNOS多克隆抗體(1∶1 000，Abcam)小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶1 000，Sigma), 4℃過夜。TBST洗滌后分別加入熒光二抗室溫孵育2 h。Odyssey雙紅外激光掃描系統(tǒng)掃描并分析條帶平均灰度值，各目的蛋白與內(nèi)參β-actin的比值表示各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的含量變化

取預(yù)先保留好的細(xì)胞培養(yǎng)液，通過ELISA試劑盒分別檢測(cè)其中的IL-1β、IGF-1與TNF-α的濃度，詳細(xì)步驟參照相應(yīng)試劑盒的使用說明(eBroscience公司)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中iNOS表達(dá)的影響

在海馬神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，Aβ1-42(5 μmol/L) 明顯上調(diào)iNOS的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，TGF-β1(5 or 20 ng/ml)在Aβ1-42加藥前1 h預(yù)處理組與單獨(dú)Aβ1-42組相比， iNOS蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，且TGF-β1(20 ng/ml)預(yù)處理組作用更明顯(P<0.01)，說明TGF-β1能夠抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)增高(圖1)。

Aβ: Aβ1-42(5 μmol/L); TGF(5): TGF-β1(5 ng/ml); TGF(20): TGF-β1(20 ng/ml)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAβ1-42;△△P<0.01vsTGF-β1(5) +Aβ1-42

2.2 TGF-β1對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞體系中炎性介質(zhì)表達(dá)和分泌的影響

為了說明TGF-β1對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中炎癥因子的影響，我們利用real-time PCR和ELISA法分別檢測(cè)TNF-α和IL-1β的基因表達(dá)及分泌(表2，3)。與正常對(duì)照組相比，Aβ1-42處理組TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；TGF-β1(5 or 20 ng/ml)預(yù)處理組與單獨(dú)Aβ1-42組相比，TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01，P<0.05)，TGF-β1(20 ng/ml)預(yù)處理組降低TNF-α表達(dá)的作用更明顯(P<0.01，表2)。同樣的，Aβ1-42處理組TNF-α和IL-1β的分泌量顯著升高(P<0.01)；TGF-β1(5 or 20 ng/ml)預(yù)處理組TNF-α和IL-1β的分泌量明顯下調(diào)(P<0.01)，TGF-β1(20 ng/ml)預(yù)處理組降低TNF-α分泌的作用更顯著(P<0.05，表3)。

GroupTNF-αIL-1βControl0.98±0.04 0.99±0.03Aβ (5 μmol/L)6.24±0.48??2.91±0.59??TGF-β1(5 ng/ml)+Aβ4.23±0.34##2.17±0.33#TGF-β1(20 ng/ml)+Aβ2.27±0.18##△△1.97±0.21##TGF-β1(5 ng/ml)1.00±0.091.17±0.16TGF-β1(20 ng/ml)0.95±0.070.98±0.09

Aβ：Aβ1-42; TGF-β1: Transforming growth factor beta 1; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-1β: Interleukin-1β

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAβ1-42;△△P<0.01vsTGF-β1(5 ng/ml) +Aβ1-42

GroupTNF-αIL-1βControl46.43±10.1214.53±4.89Aβ(5 μmol/L)94.16±7.87??31.78±9.13??TGF-β1(5 ng/ml)+Aβ72.97±6.89##20.54±5.59##TGF-β1(20 ng/ml)+Aβ60.13±7.70##△16.39±4.82##TGF-β1(5 ng/ml)45.30±10.6212.66±4.87TGF-β1(20 ng/ml)40.22±8.3911.10±3.88

Aβ: Aβ1-42; TGF-β1: Transforming growth factor beta 1; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-1β: Interleukin-1β

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAβ1-42;△P<0.05vsTGF-β1(5 ng/ml) +Aβ1-42

2.3 TGF-β1對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞體系中神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1的表達(dá)和分泌的影響

神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1的mRNA表達(dá)及分泌結(jié)果可見，與正常對(duì)照組相比，Aβ1-42處理組IGF-1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；TGF-β1(5 or 20 ng/ml)預(yù)處理組與單獨(dú)Aβ1-42處理組相比，IGF-1的mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，TGF-β1(20 ng/ml)預(yù)處理上調(diào)IGF-1 mRNA表達(dá)的作用更明顯(P<0.05)。同樣的，與正常對(duì)照組相比，Aβ1-42處理組IGF-1的分泌量明顯降低(P<0.01)。TGF-β1(5 or 20 ng/ml)預(yù)處理組較單獨(dú)Aβ1-42處理組IGF-1的分泌上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，說明TGF-β1可以抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的IGF-1 mRNA表達(dá)和分泌減少(表4)。

GroupIGF-1 mRNAIGF-1 secretion (pg/ml)Control1.01±0.05282.08±54.51Aβ (5 μmol/L)0.31±0.06??184.21±23.92??TGF-β1(5 ng/ml)+Aβ0.67±0.08##245.10±62.12#TGF-β1(20 ng/ml)+Aβ0.92±0.14##△265.32±56.53##TGF-β1(5 ng/ml)1.05±0.05319.72±39.09TGF-β1(20 ng/ml)1.12±0.13338.41±44.18

Aβ: Aβ1-42； TGF-β1: Transforming growth factor beta 1; IGF-1: Insulin-like growth factor-1

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAβ1-42;△P<0.05vsTGF-β1(5 ng/ml) +Aβ1-42

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥參與多種神經(jīng)退行性疾病。神經(jīng)炎癥成為AD的重要發(fā)病機(jī)制之一。在過度表達(dá)APP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，其腦內(nèi)可見大量的老年斑，主要集中在皮質(zhì)和海馬, 同時(shí)在這些區(qū)域也觀察到許多激活的小膠質(zhì)細(xì)胞[11, 12]。越來越多的證據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞是一個(gè)重要的致病因素，在病理情況下，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)神經(jīng)毒性作用，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如IL-1β，NO，活性氧(reactive oxygen species, ROS)和TNF-α等[13]。IGF-1是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)因子，在老年腦中減少。通常IGF-1是一種增加神經(jīng)保護(hù)作用的生長(zhǎng)因子[14]。除此之外，IGF-1還具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以減少腦中炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)，減輕LPS誘導(dǎo)的主要由小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β和 TNF-α驅(qū)動(dòng)的疾病行為[15, 16]。本實(shí)驗(yàn)室先前研究[9]發(fā)現(xiàn)相對(duì)于單獨(dú)神經(jīng)元培養(yǎng)體系，Aβ1-42對(duì)海馬神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的損傷作用更顯著，提示小膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)炎癥對(duì)神經(jīng)元損傷的促進(jìn)作用，所以本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)一些具有代表性的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)和分泌的炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1的表達(dá)和分泌變化，結(jié)果表明TNF-α、IL-1β、iNOS的表達(dá)和分泌增加，IGF-1表達(dá)和分泌下降。本實(shí)驗(yàn)室另一研究發(fā)現(xiàn)，在未作任何處理的神經(jīng)元中，TNF-α表達(dá)量較低，而在炎癥刺激后的神經(jīng)元TNF-α表達(dá)增加，而無論有無炎癥刺激，IL-1β、iNOS和IGF-1在神經(jīng)元中均未檢測(cè)出[17]。因此，Aβ1-42誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活可能是通過上調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β、iNOS的表達(dá)和分泌，下調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1的表達(dá)和分泌。

TGF-β1是一種主要來源于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)的多效應(yīng)細(xì)胞因子，具有神經(jīng)保護(hù)和免疫抑制的作用[18]。TGF-β1能夠促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的Aβ的降解，進(jìn)而發(fā)揮TGF-β1對(duì)Aβ?lián)p傷的神經(jīng)元的保護(hù)作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在海馬神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的共同培養(yǎng)體系中，TGF-β1可下調(diào)Aβ1-42誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)增加，上調(diào)Aβ1-42誘導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1的表達(dá)減少，表明TGF-β1可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子，上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1的表達(dá)分泌，對(duì)海馬神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上，Aβ1-42可以誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，釋放促炎因子iNOS、TNF-α和IL-1β增加，神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1減少，進(jìn)而引起抗炎和致炎反應(yīng)的失衡， TGF-β1可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化減少促炎因子釋放，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放來更有效的拮抗Aβ1-42對(duì)神經(jīng)元的毒性作用。