李建省，楊維建，旦孝三，孫尚龍

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

結腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，近些年發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，位居人類惡性腫瘤病死率的第3位［1-2］，嚴重危害人們的生命健康。目前臨床上對結腸癌的治療以綜合治療為主，采用放療、手術及中藥輔助化療的方法。腫瘤細胞的共性是細胞周期調控機制受到破壞導致細胞生長失控、分化受阻、衰老凋亡異常，而選擇保護正常組織并誘導腫瘤細胞分化和凋亡的新藥及有效的治療新方案，調節(jié)偏離細胞周期軌道的腫瘤細胞回到正常軌道上，是當下抗腫瘤治療的策略之一［2］。近年來有學者發(fā)現(xiàn)中藥及其提取物如：腸復康［3］、大蒜素［4］、黃連素、吳茱萸堿及小檗堿［5］等成分對體外培養(yǎng)結腸癌細胞有抑制作用。本研究探索中藥腸瘤康(由黃芪、檳榔、皂角刺、大蒜素和莪術等組成)對人結腸癌HT29細胞周期的影響，探究中藥腸瘤康抑制腫瘤增殖的作用機制，為臨床應用中藥抗腫瘤提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌HT29細胞購買于中國科學院上海生物化學和細胞生物學研究所，中藥腸瘤人結腸癌HT29細胞購買于中國科學院上海生物化學和細胞生物學研究所，中藥腸瘤康提取液由甘肅省中醫(yī)院制劑室提供，酶標儀(iMarkTM Microplate Reader，BIO-RAD)、流式細胞儀(ENC5V,USA)、二 甲 基 亞 砜 (DMSO)(NO.721D037)、RPMI-1640(AD19912263)購買自Solarbio公司。胎牛血清(RNBF3324)、MTT(SLBJ2169)、胰蛋白酶(SLBN6893V)、BCA試劑盒(RJ240514)、碘化丙啶(PI)(BCBN1506V)購買于Sigma公司。qPCR試劑盒均購自TaKaRa：PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒 (AI58964)，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(AI69802)，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%PS[100 μL 鏈霉素(100 μg/mL)和 100 IU/mL 青霉素]的RPMI-1640完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人結腸癌HT29細胞，接種至培養(yǎng)瓶后置于37℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，每3天傳代1次，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進行細胞計數(shù)，開始實驗。

1.2.2 MTT實驗 取對數(shù)生長期的人結腸癌HT29細胞，調整細胞濃度為104mL接種于96孔板內，待細胞完全貼壁后加入梯度濃度的腸瘤康溶液，分為對照組(腸瘤康 0 μg·ml-1)，腸瘤康高(100 μg·ml-1)、中(10 μg·ml-1)、低(0.1 μg·ml-1)劑量組及5-氟尿嘧啶組(5-氟尿嘧啶組4μg·ml-1)，并設置復孔。在加藥后的第24、48和72小時后加入MTT溶液，于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后小心吸棄去孔內培養(yǎng)基，每孔加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，用酶標儀測定波長490 nm處各孔的吸光值即OD值。

1.2.3 流式細胞術 細胞周期：收集用腸瘤康和5-氟尿嘧啶干預24小時后的HT29細胞，用PBS洗滌、重懸，棄上清，加入碘化丙啶(PI)溶液，進行流式細胞儀分析，并用MUTCYCLE軟件分析細胞周期分布情況。

1.2.4 熒光實時定量PCR檢測基因水平 將生長至對數(shù)期的結腸癌HT29細胞更換新鮮的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基后，用 0 μg/mL、0.1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL腸瘤康和5-氟尿嘧啶分別干預，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加適量Trizol、氯仿、異丙醇等提取各組細胞中的總RNA。取1 μL總RNA經(jīng)超微量分光光度計檢測A260/280的比值在1.8～2.0，提示RNA質量較好。總RNA用gDNA Eraser處理后，采用逆轉錄試劑盒將純化的RNA逆轉錄合成cDNA。以cDNA作為模板進行熒光PCR擴增。實時熒光定量PCR采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒，在實時熒光定量Agilent(Mx3000P)PCR儀上進行，分別擴增p16、CyclinD1、CDK4、Rb mRNA(引物序列見表 1)。每個反應設3個重復。反應條件：預變性，95℃10分鐘，1個循環(huán)；熱循環(huán)，95℃15s，60℃15s，72℃30 s，40個循環(huán)，擴增結束后確認擴增曲線和溶解曲線，確認得出的數(shù)據(jù)的可信性。計算基因的相對表達量F=2-△△Ct。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，定量資料以(χ±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗分析，方差不齊時用Dunnett′s方法分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腸瘤康對HT29細胞增殖的影響 腸瘤康能明顯抑制HT29細胞的增殖，隨著給藥劑量的增加，增殖抑制率呈上升趨勢，與對照組(0 μg/mL)相比(除24小時0.1 μg/mL腸瘤康組)，腸瘤康組增殖抑制率顯著升高（P＜0.05），有明顯的量效關系，也有一定的時間依賴性。見表2。

2.2 腸瘤康對HT29細胞周期的影響 在腸瘤康干預24小時后，與對照組相比，細胞在G1期的比例顯著增加(P＜0.05)，S期的比例顯著降低(P＜0.05)。見表3。

2.3 腸瘤康對 HT29細胞 p16、CyclinD1、CDK4、RbmRNA表達的影響 與對照組相比，p16和Rb基因在腸瘤康組中表達隨腸瘤康劑量增加依次升高；腸瘤康組CyclinD1和CDK4 mRNA的表達均下降，與對照組相比差異顯著(P＜0.05)，其中腸瘤康高劑量組下降最為顯著。見圖1。

表2 腸瘤康對結腸癌HT29細胞增殖抑制率的影響(χ±s) n=3

表3 腸瘤康對HT29細胞細胞周期的影響(χ±s) n=3

3 討論

細胞周期包含分裂間期和分裂期，分裂間期由G1期、S期和G2期組成，分裂期(M期)又分為前、中、后和末期。當G1期細胞受到調節(jié)因子調控或外界因子干擾時會進入既不生長也不分化的靜息狀態(tài)，即G0期［6］。近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期密切相關，而細胞周期的調控因子中包含多種癌基因和抑癌基因。細胞生長周期中，最重要的調控點是G1期與S期之間的調控點［7］。細胞周期的G1期與S期受細胞周期素依賴性激酶(CDKs)的活化物即細胞周期蛋白(Cyclins)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKIs)對CDKs的正負調節(jié)，也就是說細胞由G1期到S期的調控需CyclinD1的正調節(jié)和p16的負調節(jié)共同實現(xiàn)［8-9］。

在許多腫瘤中，CyclinD1由于基因擴增、染色體易位或倒置、轉錄增強、mRNA穩(wěn)定性增強等導致其蛋白過度表達。而CyclinD1過度表達可使G1期縮短，促進細胞增殖。CyclinD1基因是一種原癌基因，其蛋白的過表達與許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關［10-11］。CDKI包括2大類，一類是INK4(p15INKb、p16INKa、p18INKc、p19INKd)，主要抑制CDK4/6與CyclinD的結合及活性，抑制G1期；另一類是CIP/KIP(p21cip1/waf1、p27Kip1、p57Kip2)家族，主要抑制 CDK2、CDK3、CDK4/6，作用于細胞周期的多個階段［12］。p16蛋白與CDK競爭性結合CyclinD而阻礙CDK與CyclinD形成復合物，進而導致CyclinD/CDK激酶失活，最終阻滯細胞從G1期進入S期，細胞增殖受到抑制［13］。

中醫(yī)認為結腸癌由機體正氣不足、濕毒瘀滯凝結而致病。根據(jù)中醫(yī)臨證辨證施治原則，腸瘤康以黃芪、檳榔、皂角刺、莪術、姜黃素、大蒜素和小檗堿等為主要成分，以補中益氣，清熱利濕為主要功能。研究表明：黃芪可將人宮頸癌C-33A細胞阻滯在G1［14］，也可將小鼠肝癌細胞和肉瘤細胞阻滯在G0期，誘導腫瘤細胞凋亡［15-16］。還有研究表明黃芪、莪術配伍使用對人卵巢癌HO-8910抑瘤效果明顯［17］。皂角刺及其提取物具有治療癌癥的作用，其中皂角刺總黃酮有抑制體外培養(yǎng)的結腸癌細胞HCT1116增殖的作用，且有良好的量效關系［18-19］。

本實驗研究表明：流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)腸瘤康作用于HT29細胞24小時后，濃度在0.1～100 μg/mL內，細胞周期的G1期比例逐漸升高，S期比例明顯下降，存在G1/S阻滯。通過以上研究結果推測腸瘤康主要是通過阻滯HT29細胞G1期向S期的進程，形成G1期阻滯，造成G1期細胞堆積并阻斷DNA合成和復制，從而影響細胞周期，起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。RT-PCR研究表明，與對照組相比，p16 mRNA 表達明顯增強，CyclinD1、CDK4、RbmRNA表達明顯下降。說明腸瘤康通過調控p16、CyclinD1、CDK4、Rb等細胞周期正負調節(jié)因子的表達而發(fā)揮作用，最終抑制細胞周期順利進行，而導致腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，腸瘤康誘導的HT29細胞凋亡，可能是通過使細胞阻滯G1期無法完成自修復而發(fā)揮抗腫瘤作用，其分子機制可能與抑制p16/CyclinD1/CDK4/Rb通路有關。