馬占忠 范舒舒 徐靜 劉玉蘭 鐘延?xùn)| 郭艷樂 肖鳳金 吳平

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512026）

地中海貧血（簡稱地貧）是全球分布最廣、累及人群最多的單基因遺傳病，也是危害嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。該病高發(fā)于我國南方地區(qū)，廣東人群地貧基因攜帶率高達(dá)16.83%［1］。重型地貧是致死或致殘性遺傳病，給患者家庭和社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。開展產(chǎn)前診斷是預(yù)防重癥地貧患兒出生最有效的措施［2］。目前，地貧基因產(chǎn)前診斷的方法主要有跨越斷裂點(diǎn)PCR技術(shù)（Gap-PCR）、PCR＋導(dǎo)流雜交技術(shù)等，但這些方法手工操作煩瑣、耗時(shí)長，且實(shí)驗(yàn)過程中的影響因素多等局限性［3］。廣東省衛(wèi)生計(jì)生委頒布的《地中海貧血產(chǎn)前診斷技術(shù)規(guī)范》中要求地貧基因產(chǎn)前診斷的標(biāo)本需要兩次獨(dú)立檢測，結(jié)果一致時(shí)方可發(fā)出報(bào)告。因此，臨床上迫切需要一種更加高效、快速、準(zhǔn)確的新技術(shù)用于地貧基因產(chǎn)前診斷。本研究將探討熒光PCR熔解曲線法在地貧基因產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月至2018年5月到粵北人民醫(yī)院進(jìn)行地貧基因產(chǎn)前診斷的143例標(biāo)本（包括130例羊水、7例絨毛和6例臍血）。孕婦及家屬簽署知情同意書后，經(jīng)有資質(zhì)的臨床醫(yī)生在B超引導(dǎo)下按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程采集產(chǎn)前標(biāo)本送檢。

儀器：BIOER PCR儀、BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀、DYY-8C電泳儀、ChampGel5000凝膠成像分析儀、HB-2012A核酸雜交儀、ABI3130xl遺傳分析儀、Sebiacapillarys2 fp電泳儀和Thermo CO2恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 鑒定產(chǎn)前標(biāo)本有無母體細(xì)胞污染 用STR鑒定絨毛和羊水標(biāo)本有無母體細(xì)胞污染，血紅蛋白電泳鑒定臍血標(biāo)本有無母血污染。羊水標(biāo)本發(fā)現(xiàn)肉眼可見的紅細(xì)胞污染時(shí)先進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)，再取貼壁細(xì)胞進(jìn)行鑒定和地貧基因檢測。

1.2.2 地貧基因檢測 α-地貧和β-地貧基因按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和試劑盒說明書進(jìn)行檢測。每份標(biāo)本均用3種方法檢測。有結(jié)果不一致時(shí)，送亞能生物技術(shù)有限公司和廣東凱普生物科技股份有限公司進(jìn)行DNA測序確認(rèn)。

1.2.3 隨訪確認(rèn) 對進(jìn)行產(chǎn)前診斷后出生或流產(chǎn)、引產(chǎn)的胎兒進(jìn)行地貧基因復(fù)查和隨訪，以確認(rèn)產(chǎn)前診斷結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2 結(jié)果

2.1 絨毛和羊水標(biāo)本經(jīng)STR分析，臍血標(biāo)本經(jīng)血紅蛋白電泳分析均未發(fā)現(xiàn)母體細(xì)胞污染。

2.2 產(chǎn)前地貧基因檢測結(jié)果 共檢測了143例產(chǎn)前地貧基因（包括116例產(chǎn)前α-地貧基因和27例產(chǎn)前β-地貧基因），檢出重型α-地貧20例，重型β-地貧7例。

熒光PCR熔解曲線法檢測116例產(chǎn)前α-地貧基因標(biāo)本與Gap-PCR檢測結(jié)果均一致，與導(dǎo)流雜交法有1例不符，熒光PCR熔解曲線法和Gap-PCR檢測結(jié)果是-α3.7／αα，導(dǎo)流雜交法檢測結(jié)果是--SEA／-α3.7，該標(biāo)本 DNA 測序結(jié)果為-α3.7／αα，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析是由于該例絨毛標(biāo)本有極微量母體細(xì)胞污染，導(dǎo)流雜交法靈敏度高，導(dǎo)致假陽性。熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)果符合率達(dá)100%，見表1。

表1 116例產(chǎn)前α-地貧基因檢測結(jié)果

熒光PCR熔解曲線法檢測27例產(chǎn)前β-地貧基因標(biāo)本與PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)果均相同，與導(dǎo)流雜交法有1例不符，熒光PCR熔解曲線法和PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)果是IVS-II-654M／N，導(dǎo)流雜交法檢測結(jié)果是IVS-II-654M／CAPM，該標(biāo)本DNA測序結(jié)果為IVS-II-654M／N，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析是由于該例絨毛標(biāo)本有低比例母體細(xì)胞污染，導(dǎo)流雜交法靈敏度高，導(dǎo)致假陽性。熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)果符合率達(dá)100%，見表2。

3 討論

熒光PCR熔解曲線法是通過熒光PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測溫度和熒光強(qiáng)度的變化生成熔解曲線，通過分析探針與靶序列形成雜交體的熔點(diǎn)溫度（Tm值），不同突變點(diǎn)有不同的熔解溫度，據(jù)此計(jì)算野生型與突變型Tm值的差值（△Tm），即可判斷突變位點(diǎn)［4］。在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于G6PD缺乏癥、結(jié)核分枝桿菌和沙門菌分型等疾病的檢測［5-7］。

表2 27例產(chǎn)前β-地貧基因檢測結(jié)果

熒光PCR熔解曲線法與傳統(tǒng)的PCR＋電泳或雜交法比較有以下優(yōu)點(diǎn)：①快速：PCR儀直接判讀結(jié)果，免去了電泳和雜交等繁瑣的人工操作環(huán)節(jié)，整個(gè)過程可在3小時(shí)內(nèi)出結(jié)果；②閉管操作，最大程度減少交叉污染；③基因覆蓋范圍廣：不僅可以判斷探針覆蓋的突變類型，還可以發(fā)現(xiàn)探針覆蓋區(qū)域的未知突變點(diǎn)；④檢測結(jié)果可直接導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)，減少人工判讀和輸入時(shí)的差錯(cuò)［8］。

熒光PCR熔解曲線法也存在局限性：①可檢測到探針覆蓋區(qū)域的其他突變，但是無法判斷具體類型，還需要通過其他方法進(jìn)一步確診；②儀器自動判讀有時(shí)會出錯(cuò)，需要人工對每個(gè)標(biāo)本每個(gè)通道的峰型進(jìn)行判斷和審核；③儀器要求高，需要儀器具備多通道熒光檢測和高分辨熔解曲線分析功能。

任何一種檢測技術(shù)均存在其方法學(xué)的優(yōu)缺點(diǎn)。根據(jù)國家規(guī)定，產(chǎn)前診斷項(xiàng)目需兩次獨(dú)立檢測，結(jié)果一致時(shí)方可發(fā)出報(bào)告。實(shí)踐證明，最好采用不同技術(shù)原理的兩種方法獨(dú)立檢測，相互驗(yàn)證，提高準(zhǔn)確率，防止漏診誤診造成的嚴(yán)重后果，為預(yù)防出生缺陷提供技術(shù)保障。

本研究中143例產(chǎn)前樣本中檢出重型地貧27例，經(jīng)遺傳咨詢醫(yī)生與孕婦及家屬進(jìn)行溝通，在簽署知情同意后選擇了終止妊娠，有效避免了重癥地貧患兒的出生。尤其開展11～14周絨毛產(chǎn)前地貧基因檢測，可以更大程度地減輕對孕婦的身心傷害。但絨毛采樣流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)和母體細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)需要警惕。本研究中經(jīng)STR檢測均未發(fā)現(xiàn)母體細(xì)胞污染，但在地貧基因檢測發(fā)現(xiàn)2例絨毛標(biāo)本，導(dǎo)流雜交法與其他兩種方法檢測結(jié)果不一致，最終測序分析是由于發(fā)生低比例的母體細(xì)胞污染所致。導(dǎo)流雜交法檢測地貧基因的高靈敏度和STR檢測母體細(xì)胞污染的低靈敏度都值得警惕。肖奇志等［9］研究報(bào)道中也表明導(dǎo)流雜交法靈敏度高于其他方法。有研究證實(shí)當(dāng)母體細(xì)胞污染比例小于10%時(shí)，STR方法可能無法測出［10，11］。實(shí)踐中仍需探索排除產(chǎn)前診斷標(biāo)本母源污染的有效方法，避免誤診。

綜上所述，熒光PCR熔解曲線法檢測143例產(chǎn)前地貧基因結(jié)果與傳統(tǒng)的Gap-PCR和反向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測結(jié)果一致，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于地中海貧血基因產(chǎn)前診斷。