曾憲思，賈金婧，陳 磊，余亞軍，宋新強

(1.信陽師范學院a.生命科學學院; b.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用研究院, 河南 信陽 464000；2.信陽市林業(yè)工作站，河南 信陽 464000)

0 引言

外源性刺激或內(nèi)源性壓力可以導致DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB).在細胞自身調控過程中還存在程序性DSB，如可變區(qū)基因(多樣化基因)連接區(qū)基因片段重組(variable(diversity)joining recombination，V(D)J)和類別轉換重組(class switch recombination，CSR)均可產(chǎn)生程序性DSB.DSB是最嚴重的DNA損傷類型.細胞在應對DNA損傷時會啟動DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)，包括DNA損傷部位的檢測、DNA損傷信號的傳遞與DNA損傷修復系統(tǒng)的啟動即啟動非同源末端連接途徑(non-homologous end joining，NHEJ)修復DNA損傷.

DDR對維持正常的細胞功能至關重要，DNA雙鏈斷裂被正確修復后細胞可以存活，被錯誤修復將導致染色體畸變或易位，這種含有DNA損傷的病變細胞可發(fā)展為惡性腫瘤.程序性DDR障礙將導致原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiency，ID)[1].DNA損傷信號或NHEJ缺陷的病人具有PID表型，包括放射敏感性、惡性腫瘤易感性、發(fā)育遲緩與神經(jīng)功能缺損[2].這些疾病使我們認識了每一DDR相關蛋白的生理意義和功能.本文將介紹V(D)J重組與CSR產(chǎn)生程序性DDR的分子機制，以及DDR相關蛋白缺陷導致的PID表型.

1 V(D)J重組與CSR重組產(chǎn)生DDR的分子機制

1.1 V(D)J重組

V(D)J重組是發(fā)生在免疫球蛋白與T細胞受體的DNA重排過程，對B淋巴細胞和T淋巴細胞的發(fā)育至關重要.為了應對外來抗原，淋巴細胞將產(chǎn)生大量的抗原受體，包括B細胞受體和T細胞受體.這些受體可變域即抗原結合域的編碼基因是由彼此分離的2或3個基因片段(VJ或VDJ)通過V(D)J重組組裝而成，而V、D和J片段本身具有不同的拷貝，因此通過V、D、J基因片段的重組或V、J基因片段的重組可使抗原受體呈現(xiàn)多樣性.淋巴細胞特有的重組酶RAG1/2與每一個即將發(fā)生重排V、D、J片段兩端的重組信號序列(recombination signal sequences，RSS)結合，催化基因片段本身和RSS之間的雙鏈DNA斷裂，最后通過NHEJ將斷裂的DNA末端連接起來[3].當發(fā)生DSB時，B細胞受體或T細胞受體基因編碼區(qū)末端形成共價封閉的DNA發(fā)卡結構，DNA依賴的蛋白激酶(DNA dependent protein kinase，DNA-PK)的調節(jié)亞基Ku70/80與DNA-PK催化亞基(DNA-PK catalytic subunit，DNA-PKcs)結合在發(fā)卡結構上，形成具有全酶活性的DNA-PK；然后，募集Artemis與DNA-PKcs形成復合體.DNA-PK磷酸化Artemis，活化的Artemis具有核酸內(nèi)切/外切酶活性可打開發(fā)夾結構.DNA損傷信號分子在這種程序性DDR中也具有重要作用.ATM與MRE11-RAD50-NBS1復合物(MRN)募集在DNA斷裂位點并啟動DDR信號[4,5].環(huán)指蛋白168(ring finger protein168，RNF168)與p53結合蛋白1(p53-binding protein 1，53BP1)也可以促進DDR，RNF168可以對53BP1進行泛素化修飾[6].最后，DNA連接酶IV/XRCC4-XLF復合物通過NHEJ修復DSB[7].

1.2 CSR重組

免疫球蛋白的類別轉換重組(class switch recombination，CSR)發(fā)生在其重鏈的恒定區(qū)，Cμ被 Cγ、Cα或 Cε取代后形成IgG、IgA與IgE.B細胞可以進行CSR即Ig重鏈區(qū)被另一個Ig區(qū)所取代，使B細胞產(chǎn)生不同的Ig亞型.活化誘導的胞苷脫氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID) 可以將轉錄活化的S區(qū)的胞嘧啶脫氨基轉化為尿嘧啶并啟動CSR.引入的尿嘧啶被尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UNG)修飾并通過堿基切除修復途徑切除，脫堿基位點被脫嘌呤/脫嘧啶核苷酸內(nèi)切酶切割產(chǎn)生DNA單鏈斷裂(single strand break，SSB)，SSB隨后轉變?yōu)镈SB.錯配修復也可以通過MMR復合物(MSH2、MSH6、MLH1、PMS2與 EXO1)產(chǎn)生DSB.Sμ/Sx突觸由ATM/MRN/53BP1/RNF168/γ-H2AX修復后，隨后通過與V(D)J重組最后過程相同的機理進行修復[8].CSR過程盡管不形成發(fā)卡結構，但也需Artemis參與[9].

2 V(D)J重組中DDR相關蛋白缺陷及其引起的表型

2.1 ATM缺陷

ATM激酶通過磷酸化多種DDR分子在DDR中發(fā)揮核心作用.ATM激酶不僅可以修復DSB、調節(jié)細胞周期、決定細胞命運，還參與轉錄調控、端粒與線粒體維持、無義介導的衰變與自噬.ATM缺失會導致體細胞同源修復缺陷，抑制ATM活性則顯著降低同源修復[10].ATM激酶缺陷與染色體破碎增加密切相關，導致易患白血病等惡性腫瘤[11].ATM突變可引起共濟失調毛細血管擴張癥(ataxia telangiectasia，A-T).A-T是一種常染色體隱性遺傳并涉及多系統(tǒng)病變的神經(jīng)退行性疾病，其主要特征為早發(fā)性共濟失調、毛細血管擴張以及惡性腫瘤發(fā)病率增加[12].A-T最顯著的臨床表現(xiàn)是放射敏感性.大約30%的A-T患者表現(xiàn)出免疫缺陷，如由V(D)J重排效率降低與新生T細胞減少引起的T細胞數(shù)目減少.A-T患者中通常發(fā)生血清α-胎蛋白減少、7號染色體與14號染色體的易位等變化.

2.2 MRN復合物缺陷

在DDR信號中，MRE11、RAD50和NBN(NBS1)形成復合物結合DSB通過激活ATM激酶引發(fā)細胞周期檢驗點,從而在DNA修復中發(fā)揮功能，每一組分對穩(wěn)定復合物的形成至關重要，但在免疫反應尤其是V(D)J重組與CSR中的功能卻各不相同.MRE11缺陷患者表現(xiàn)出共濟失調性毛細血管擴張癥樣障礙，如共濟失調、小腦萎縮和眼睛不適，但不發(fā)生毛細血管擴張.MRE11缺陷患者并未出現(xiàn)免疫學異常，但易患惡性腫瘤[13].NBS1的磷酸化狀態(tài)決定端粒DNA的修復選擇[14]，NBN缺陷可以導致奈梅亨斷裂綜合征(Nijmegen Breakage syndrome，NBS)，即染色體不穩(wěn)定綜合征，特征為小頭癥、鳥樣臉、生長遲緩、輕度智力低下、免疫缺陷和癌癥高發(fā).免疫學研究表明幾乎一半的淋巴細胞明顯減少的患者伴有輕度或重度的白細胞減少.T細胞絕對數(shù)量降低的大部分患者伴有CD4+T細胞的減少，且四分之三的NBS患者出現(xiàn)了B細胞減少.RAD50的ATPase活性是MRN復合物的催化核心之一，受DNA末端調控[15]，其缺陷可以導致與NBS相似的表型，如小頭癥、智力遲鈍、鳥樣臉與身材矮小，但淋巴細胞數(shù)量和免疫球蛋白表達水平均正常[16].

2.3 RAG1/2缺陷

RAG1/2在V(D)J重組中具有重要作用，其突變將導致B細胞與T細胞缺陷,并表現(xiàn)出B-T-NK+重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)表型.用RAG1免疫缺陷患者的誘導多能干細胞模擬PID可改變T細胞的發(fā)育[17].重組活性部分喪失的患者表現(xiàn)出多種表型，如Omenn綜合征(Omenn syndrome，OS)，該病的早期臨床表現(xiàn)為紅皮病、肝脾腫大、淋巴結腫大、脫發(fā)、常伴嗜酸性粒細胞與血清IgE升高.據(jù)報道，在常見變異型免疫缺陷病與IgA缺乏癥的病人中存在RAG1的次形態(tài)突變[18].盡管RAG1/2缺陷的SCID患者對放射不敏感，也沒有表現(xiàn)出發(fā)育延遲，但確診后就需要盡快進行造血細胞移植.

2.4 Artemis缺陷

核酸酶Artemis對B淋巴細胞和T淋巴細胞的發(fā)育至關重要，其C-端和催化結構域的生理相互作用可介導自身活性抑制[19].DNA-PKcs 與ATM可以磷酸化Artemis，但其活化主要由DNA-PKcs所催化.Artemis編碼基因DCLRE1C缺陷表現(xiàn)出B-T-NK+放射敏感型SCID[20].DCLRE1C突變通常發(fā)生在N-末端區(qū)域導致其核酸酶活性喪失.DCLRE1C啟動子前存在假DCLRE1C基因，由野生型DCLRE1C與假DCLRE1C基因之間的同源重組引起外顯子1-3或1-4的缺失是最常見的突變.DCLRE1C的次形態(tài)突變可引起非典型SCID、OS、高IgM綜合征等表型，然而Volk等研究證明Artemis突變僅導致抗體缺陷[21].Artemis缺陷的病人易患淋巴瘤.與LIG IV缺陷或XLF缺陷相比，Artemis缺陷的放射敏感性并不顯著，且患者沒有出現(xiàn)生長遲緩或神經(jīng)功能缺損等癥狀.

2.5 DNA連接酶IV (LIG IV) 缺陷

DNA連接酶IVA(DNA ligase IV，LIG IV)是DNA連接酶家族成員之一，參與V(D)J重組過程中DSB的修復，可激活Artemis 的核酸酶活性[22].LIG IV缺陷最初在白血病患者中發(fā)現(xiàn)，且化療對該患者具有嚴重副作用.隨后，在小頭畸形、生長遲緩、全血細胞減少和不同程度免疫功能障礙的患者中也發(fā)現(xiàn)了LIG IV缺陷.這些病人的表型介于正常人與B-T-NK+放射敏感的SCID之間.LIG IV缺陷后引起的常見癥狀包括生長不足、嚴重的小頭畸形、全血細胞減少且易患淋巴惡性腫瘤[23].LIG IV的錯義突變使其活性降低并表現(xiàn)出聯(lián)合免疫缺陷.患者隨著B、T和NK細胞的減少而呈現(xiàn)出廣泛的免疫學異常.

2.6 XLF(NHEJ1)缺陷

在NHEJ中，XLF與XRCC4-LIG IV相互作用激活其連接酶活性進行損傷修復，由于XLF是LIG IV復合物的一個組成部分，因此推測XLF在V(D)J重組中具有重要作用.XLF基因突變可導致端粒酶基因表達降低和端粒變短[24].XLF可以引起N-核苷酸的插入從而產(chǎn)生受體多樣性[25].在放射敏感性SCID與血細胞減少的患者中發(fā)現(xiàn)了XLF缺陷，導致造血干細胞損傷與早衰并引起血細胞減少[26].XLF突變病人小頭畸形、淋巴球減少、生長阻滯，并表現(xiàn)出免疫缺陷和放射敏感性[27].然而，與其他SCID相比，XLF對免疫系統(tǒng)的影響相對較小.最近研究表明XLF不是V(D)J重組必需的.XLF缺陷小鼠一種新的NHEJ因子PAXX可促進Ku在DSB處募集修復損傷[28].RAG蛋白除了識別并結合RSS以外，在斷裂末端的解離與重接中也具有重要作用.XLF缺失時，RAG復合物在DSB修復中起輔助作用[29].

2.7 PRKDC(DNA-PKcs)缺陷

DNA-PK由DNA-PKcs和Ku70/80組成，在NHEJ DNA修復途徑中發(fā)揮重要作用[30].DNA-PKcs與Ku70/80在人體內(nèi)含量豐富，它們在基因組穩(wěn)定性的維持中可能起到一定作用.突變的DNA-PKcs具有正常的激酶活性，但不能活化Artemis.van Der Burg對沒有出現(xiàn)發(fā)育遲緩或RAG1/2突變的B-T-NK+重癥聯(lián)合免疫缺陷患者進行基因分析發(fā)現(xiàn)了PRKDC的純合突變[31].Mathieu等研究發(fā)現(xiàn)PRKDC缺陷患者的DNA-PKcs蛋白水平減少、激酶活性檢測不到且DSB修復受損，該患者具有小頭畸形、發(fā)育遲緩與嚴重的神經(jīng)功能缺陷，表明DNA-PKcs在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中具有重要作用，同時DNA-PKcs突變不能誘導自身免疫調節(jié)因子依賴的基因表達，會出現(xiàn)器官特異性的自免疫炎癥疾病[32].

3 CSR重組中DDR相關蛋白缺陷及其引起的表型

3.1 AID缺陷與UNG缺陷

B細胞中AID對抗體多樣性非常關鍵，它通過誘導產(chǎn)生DNA斷裂來進行CSR、基因轉換與體細胞超突變(somatic hypermutation，SHM)[33].編碼AID的AICDA基因缺陷是引起常染色體隱性遺傳高IgM綜合征最常見的原因[34]，UNG缺陷也可以導致高IgM綜合征.發(fā)生應激時AID的表達上調，并將兩條DNA鏈上IgH基因轉換區(qū)的脫氧胞嘧啶脫氨基轉化為脫氧尿嘧啶而啟動CSR，隨后UNG將DNA上的脫氧尿嘧啶移除并啟動DNA修復途徑[35].AID缺陷與UNG缺陷表現(xiàn)出淋巴結增生.對22個AID缺陷的患者進行分析，其中6個患者有自身免疫病或炎癥，包括糖尿病、關節(jié)炎、自身免疫性肝炎、溶血性貧血、免疫性血小板減少癥、克羅恩病和慢性葡萄膜炎.

3.2 INO80缺陷

INO80是染色質重構復合物的組成成分，哺乳動物INO80是端粒復制必需的，能維持基因組的穩(wěn)定性[36].INO80通過移除DNA損傷部位的H2A.Z促進突觸前纖維形成，進而促進了同源重組修復[37].在B細胞中的Sα和Eμ區(qū)域可以檢測到INO80與黏附亞單位SMC，表明INO80在CSR中具有一定作用.Kracker等在兩名IgM水平正常、IgG和IgA水平降低的患者中發(fā)現(xiàn)了INO80的缺陷[8].有研究表明，INO80可促進子宮肌瘤和非小細胞性肺癌等腫瘤的發(fā)生，提示我們靶向INO80染色質重構復合物可能是潛在的腫瘤治療策略[38].

3.3 錯配修復缺陷

在遺傳性非息肉病性結腸直腸癌與林奇綜合征患者中發(fā)現(xiàn)了錯配修復基因的突變.結構性錯配修復缺陷(constitutional mismatch repair deficiency，CMMRD)綜合征是一種惡性腫瘤易感疾病，該病源于四個錯配修復基因PMS2、MSH6、MSH2或 MLH1的雙等位基因突變[39].該病瘤譜很廣，主要包括血液、大腦和腸道腫瘤.PMS2缺陷會導致DNA先導鏈的高突變性，進而導致早期腦腫瘤發(fā)作[40].MSH6缺陷可以適度減少IgG尤其是IgG2亞型的水平，但不能減少IgA的水平，這種缺陷導致了Ig-CSR部分缺陷與SHM異常.體細胞MSH2和MLH1突變引起的錯配修復缺陷會導致林奇綜合征樣腫瘤[41].

3.4 RNF168缺陷

發(fā)生DSB時，E3連接酶RNF168通過使H2A泛素化調節(jié)DNA損傷修復[42].同時RNF168還介導53BP1的泛素化，這一修飾對53BP1在DSBs位點的募集和發(fā)揮其DNA損傷修復、檢驗點調節(jié)與基因組完整性的維持等功能至關重要[6].RNF168缺陷會導致放射敏感性、免疫缺陷、體態(tài)異常和學習困難(RIDDLE)綜合征，它是一種與DSB修復缺陷有關的免疫缺陷病[43].RIDDLE患者體內(nèi)IgG 與IgA水平減少，且其臨床特點與A-T相同.RIDDLE患者細胞內(nèi)53BP1與 BRCA1在DSBs上的重新定位受損，但MDCI與NBS1在DSBs上的重新定位并未受到影響.

4 DDR缺陷導致免疫缺陷的治療措施

無論NK細胞是否存在，B-T-放射敏感性SCID表型的患者都會出現(xiàn)復發(fā)或嚴重感染，因此治療時需要重建免疫系統(tǒng).B-T-放射敏感性SCID包括DCLRE1C (Artemis)、LIG IV與XLF的缺陷.對放射敏感性SCID進行造血細胞移植的結果表明，最小劑量的烷化劑和電離輻射對于提高存活率和降低遠期影響至關重要[44].清髓性預處理方案很容易導致LIG IV與XLF的缺陷患者死亡，需要采用降低強度預處理方案.另一方面，患者殘余的NK活性會排斥供體造血細胞.Artemis缺陷不會導致造血干細胞缺陷，在移植前需要用藥物來清除宿主造血細胞和打開骨髓龕.目前常用的一個預處理方案是氟達拉濱、低劑量環(huán)磷酰胺和血清療法聯(lián)合治療以清除T細胞.我們期待能研發(fā)出一種可抑制殘余NK細胞活性和產(chǎn)生骨髓龕的非基因毒性預處理方案.

5 展望

近年來對DDR相關蛋白缺陷引起的原發(fā)性免疫缺陷表型進行了比較廣泛的研究，這可為相關疾病的臨床診斷提供依據(jù)，為其臨床治療提供很好的思路.盡管如此，DDR相關蛋白缺陷所致原發(fā)性免疫缺陷疾病的確切致病機制仍不完全清楚.因此構建新的DDR缺陷相關原發(fā)性免疫缺陷疾病動物模型，尤其是非人靈長類動物模型，這將有利于更好地研究并闡明其發(fā)病機理，并在此基礎上開展更具針對性的治療.