曹彥強(qiáng) 閆小娟 羅紅燕 賈仲君 蔣先軍?

（1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715）

（2 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008）

微生物是土壤中最活躍的組成，在土壤C、N、S、P等養(yǎng)分循環(huán)中均起著重要作用［1］。硝化過(guò)程是全球N循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，是指在好氧條件下銨態(tài)氮被氧化為硝態(tài)氮的過(guò)程，它是由微生物所驅(qū)動(dòng)的，分別由兩類化能自養(yǎng)微生物參與完成：首先是氨氧化微生物（Ammonia-oxidizing microorganisms，AOM）將氨氧化為亞硝態(tài)氮，再由亞硝酸氧化細(xì)菌（NOB）將亞硝態(tài)氧化為硝態(tài)氮，其中能將氨氧化為亞硝態(tài)氮的氨氧化微生物包括氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）［2-4］。但新發(fā)現(xiàn)的全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）卻在逐漸改變?nèi)藗儗?duì)硝化作用的傳統(tǒng)認(rèn)知，它能夠?qū)@態(tài)氮直接氧化為硝態(tài)氮［5-8］。

早期基于細(xì)胞的形狀和內(nèi)細(xì)胞膜的排列方式將氨氧化細(xì)菌分為不同的屬［9］。根據(jù)伯杰氏分類手冊(cè)，氨氧化細(xì)菌分為亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化球菌屬（Nitrosococcus）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）和亞硝化弧菌屬（Nitrosoνibria）［9-10］。近年來(lái)基于16S rRNA基因序列同源性的比較為研究氨氧化細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育提供了新的工具，氨氧化細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育角度由2類不同的菌屬組成，分別為變形菌門（Proteobacteria）的 β和γ 亞綱。已發(fā)現(xiàn)的土壤和淡水中的氨氧化細(xì)菌均屬于這兩個(gè)類群。其中β 亞綱的氨氧化細(xì)菌分為亞硝化單胞菌群（Nitrosomonas）和亞硝化螺菌群（Nitrosospira）兩個(gè)分支。Head等［11-12］在這一研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析，亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化葉菌屬（Nitrosolobus）和亞硝化弧菌屬（Nitrosoνibria）的基因序列同源性很好，將三者劃分為同一菌屬Nitrosospira。γ 亞綱單獨(dú)形成一個(gè)分枝亞硝化球菌屬（Nitrotscoccus）。因此現(xiàn)在基本按Nitrosococcus、Nitrosomonas和Nitrosospira分成三類。與氨氧化細(xì)菌不同，亞硝酸氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育則要復(fù)雜許多，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一般將NOB分為四個(gè)屬［13］：硝化桿菌屬（Nitrobacter）、硝化球菌屬（Nitrococcus）、硝化刺菌屬（Nitrospina）和屬于硝化螺菌門（Nitrospirae）的硝化螺菌屬（Nitrospira）。

紫色土是土壤學(xué)科中具有特殊地位的土壤之一，主要分布在中國(guó)的亞熱帶地區(qū)，以四川盆地為主，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有十分重要的地位。按照pH和碳酸鹽含量分為酸性、中性和石灰性紫色土［14］。土壤pH是影響土壤硝化作用的因素之一，不僅會(huì)對(duì)土壤硝化作用的進(jìn)程產(chǎn)生影響，而且還會(huì)對(duì)硝化微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響［15］。

本實(shí)驗(yàn)選取采自重慶永川的酸性紫色土（pH=5.3）和中性紫色土（pH=7.2）以及四川鹽亭的石灰性紫色土（pH=8.5），采用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)Miseq測(cè)序揭示三種不同的紫色土中總微生物和硝化微生物群落的分布情況，為進(jìn)一步研究紫色土中的硝化作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

酸性紫色土采自重慶永川（2 9°1 1′N ，105°47′E），海拔582 m；中性紫色土采自重慶永川（29°23′N ，105°59′E），海拔387 m，亞熱帶氣候，全年平均氣溫19.7℃，平均降水量1400 mm；石灰性紫色土采自四川鹽亭中國(guó)科學(xué)院成都山地所（N31°16′，E105°28′），海拔400～600 m，亞熱帶氣候，全年平均氣溫17.3℃，平均降水量826 mm。

表1 三種紫色土的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physico-chemical properties of the three types of purple soils tested

1.2 土壤樣品培養(yǎng)

13CO2標(biāo)記處理，即13C-尿素處理。每周每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入178.6 μl的0.1 mol L-1的尿素溶液，使得每克干土中N的濃度達(dá)到 100 μg（將尿素溶液逐滴加入土壤，盡量均勻地加在培養(yǎng)瓶底部所有土壤表面）。加完尿素后密封培養(yǎng)瓶，隨后注入6.0 ml的13CO2，進(jìn)一步培養(yǎng)。

12CO2對(duì)照處理，即12C-尿素處理。每周每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入178.6 μl的0.1 mol L-1的尿素溶液，密封培養(yǎng)瓶，隨后注入6.0 ml的12CO2，進(jìn)一步培養(yǎng)。

13CO2+C2H2對(duì)照處理，即13C-尿素加1 000 Pa C2H2抑制處理。每周每個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入178.6 μl的0.1 mol L-1的尿素溶液，密封培養(yǎng)瓶，隨后注入6.0 ml的13CO2以及1.2 ml的C2H2，進(jìn)一步培養(yǎng)。

培養(yǎng)8周后樣品采集，利用試劑盒提取土壤基因組總DNA，采用 FastDNA? SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals公司）試劑盒進(jìn)行提取。

1.3 總微生物量（16S rRNA）-Miseq 測(cè)序

目的基因的擴(kuò)增及純化：（1）將提取的DNA樣品利用通用引物（515F/907R）擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃，5 min；32×（94℃，30s；54℃，30 s；72℃，45 s）；72 ℃，10 min；在4℃下保存，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。515F/907R引物對(duì)樣品微生物 DNA 的16S rRNA的 V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。（2）獲得土壤DNA水平的16SrRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物后，將PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0 試劑盒（Takara公司）純化，純化產(chǎn)物溶解于25 μl無(wú)菌超純?nèi)ルx子水。（3）純化后的PCR 產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化效果，利用微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度。

Miseq文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序：將不同樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合后，進(jìn)行Miseq文庫(kù)構(gòu)建，進(jìn)行Miseq序列分析。測(cè)序在中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所分析測(cè)試中心完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

M i s e q測(cè)序得到的結(jié)果采用R D P o n l i n e analysis、 Mothur 等軟件及方法分析。采用Excel 2010和SPSS 13對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 三種紫色土各處理的凈硝化速率

經(jīng)過(guò)56 d的培養(yǎng)后，三種紫色土各處理的凈硝化速率如圖1所示。酸性紫色土12CO2、13CO2+C2H2和13CO2處理的凈硝化速率依次為：0.036、0.012、0.027 mg kg-1d-1，酸性紫色土未發(fā)生明顯的硝化作用。中性紫色土的凈硝化速率為：8.373、0.199、8.123 mg kg-1d-1，石灰性紫色土的凈硝化速率為：10.233、0.573、9.676 mg kg-1d-1。在pH較高的中性和石灰性土壤中發(fā)生了明顯的硝化作用。

圖1 3種不同pH紫色土的硝化作用Fig. 1 Net nitrification rates in the three purple soils with differentpH

2.2 三種紫色土各處理門水平群落組成

三種紫色土各處理樣品中微生物類群占土壤微生物總量的比例如圖2所示。三種紫色土中均檢測(cè)到了變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等。但其相對(duì)豐度在三種紫色土各處理樣品中存在較大差異。豐度低于1%的微生物合并為Other。

酸性紫色土培養(yǎng)初期（S0）Proteobacteria占微生物總量的32.5%。加入尿素經(jīng)過(guò)56 d培養(yǎng)13C處理（S56-13C）和乙炔抑制處理（S56-C2H2）后Proteobacteria占微生物總量的比例分別為25.8%和23.9%，均有一定程度的下降。中性紫色土中加入尿素經(jīng)過(guò)56d培養(yǎng)13C處理（Z56-13C）和乙炔抑制處理（Z56-C2H2）后Proteobacteria占微生物總量的32.8%和27.5%，相比于培養(yǎng)初期的28.6%，乙炔處理抑制了Proteobacteria的增長(zhǎng)。石灰性紫色土中加入尿素經(jīng)過(guò)56d培養(yǎng)13C處理（J56-13C）和乙炔抑制處理（J56-C2H2）后Proteobacteria占微生物總量的比例分別為29.2%和30.7%。中性紫色土和石灰性紫色土中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）的比例大于酸性紫色土。

圖2 三種紫色土各處理樣品土壤微生物門水平分類比例Fig. 2 Proportions of soil microbes by phylum in the three purple soils with different pH

2.3 三種紫色土各處理硝化細(xì)菌群落組成

在所有序列中挑出屬于AOB和NOB的序列，三種紫色土各處理AOB和NOB占總序列的比例如圖3。

酸性、中性和石灰性紫色土培養(yǎng)初期（S0、Z0和J0）AOB分別占總序列的0.032%、0.193%和0.0 4 2%，N O B分別占總序列的0.0 3 8%、0.769%和0.649%。加入尿素經(jīng)過(guò)56d培養(yǎng)13C處理（S56-13C、Z56-13C和J56-13C）AOB分別占總序列的0.034%、0.298%和0.324%，NOB分別占0.038%、1.111%和1.324%。加入尿素經(jīng)過(guò)56d培養(yǎng)乙炔抑制處理（S56-C2H2、Z56-C2H2和J 5 6-C2H2）A O B分別占總序列的0.0 3 8%、0.067%和0.036%，NOB分別占0.084%、0.88%和1.012%。酸性紫色土加入尿素經(jīng)過(guò)56 d培養(yǎng)13C處理和乙炔抑制處理的NOB和AOB比例均無(wú)明顯變化。中性紫色土經(jīng)過(guò)培養(yǎng)NOB比例分別增長(zhǎng)了1.4倍和1.1倍；AOB比例分別增長(zhǎng)了1.5倍和0.34倍。石灰性紫色土經(jīng)過(guò)培養(yǎng)NOB比例分別增長(zhǎng)了2.1倍和1.5倍；AOB分別增長(zhǎng)了7倍和0.86倍。NOB/AOB的值在三種紫色土各處理中最高可達(dá)到13。

圖3 三種紫色土各處理AOB和NOB占總微生物的百分比Fig. 3 Relative abundance of AOB and NOB in the three purple soils with different pH

三種紫色土各處理下AOB和NOB序列在屬水平百分比如圖4，其中硝化螺菌屬（Nitrospira）和硝化球菌屬（Nitrococcus）屬于NOB，亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）屬于AOB。三種紫色土各處理AOB主要以Nitrosospira為主，NOB主要以Nitrospira為主。

酸性、中性和石灰性紫色土培養(yǎng)初期（S0、Z0和J0）AOB分別占52.5%、21.3%和7.6%，NOB分別占47.5%、78.7%和92.4%，酸性、中性和石灰性紫色土加入尿素培養(yǎng)56 d13C處理（S56-13C、Z56-13C和J56-13C）AOB分別占46.4%、21.1%和17.5%，NOB分別占53.6%、78.8%和82.5%。酸性、中性和石灰性紫色土加入尿素培養(yǎng)56d乙炔抑制處理（S56-C2H2、Z56-C2H2和J56-C2H2）AOB分別占33.8%、7.5%和15.5%，NOB分別占66.2%、92.5%和84.5%。經(jīng)過(guò)56d培養(yǎng)13C處理后，酸性紫色土AOB所占比例下降幅度較大，中性紫色土有較小幅度的下降，石灰性紫色土所占比例增加。經(jīng)過(guò)56d培養(yǎng)乙炔抑制處理后，酸性紫色土、中性紫色土AOB所占比例均有較大幅度下降，NOB所占比例變化情況相反。而石灰性紫色土AOB所占比例有較小幅度的增長(zhǎng)，NOB所占比例有所下降。

圖4 三種紫色土各處理AOB和NOB在屬水平所占的百分比Fig. 4 Relative abundance of AOB and NOB at the level of genera in the three purple soilswith different pH

3 討 論

實(shí)驗(yàn)室模擬試驗(yàn)與田間試驗(yàn)結(jié)果均表明：硝化作用在一定的范圍內(nèi)隨著 pH 的升高而增強(qiáng)［16-20］。本次試驗(yàn)的結(jié)果表明，pH8.5的石灰性紫色土和pH7.2的中性紫色土中發(fā)生了強(qiáng)烈的硝化作用，而pH5.3的酸性紫色土中硝化作用則較為微弱。隨著pH的升高，紫色土中的硝化作用也有著明顯的增強(qiáng)。

本研究中，在乙炔抑制處理下的紫色土中幾乎未發(fā)生硝化作用，而未加乙炔的處理有明顯的硝化作用，表明三種不同pH紫色土中的硝化作用類型均以自養(yǎng)硝化作用為主。乙炔是一種常用的自養(yǎng)硝化抑制劑，在很多情況下較低的乙炔濃度可以抑制土壤的自養(yǎng)硝化作用［21］。土壤中的自養(yǎng)硝化微生物利用硝化作用產(chǎn)生的能量同化 CO2自養(yǎng)生長(zhǎng)。

三種紫色土中均檢測(cè)到了變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），但其占比在三種紫色土中存在著顯著的差異。不同的土壤條件，例如pH，會(huì)影響微生物和硝化微生物的分布情況［22-23］。中性紫色土和石灰性紫色土各處理中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）百分比大于酸性紫色土各理。

AOB隸屬于Proteobacteria，在三種紫色土中均檢驗(yàn)到了較高的占比。但酸性紫色土中的硝化作用遠(yuǎn)小于中性紫色土和石灰性紫色土，表明在酸性紫色土的硝化作用中AOB并不起主導(dǎo)作用［24-25］。加入尿素經(jīng)過(guò)56 d培養(yǎng)13C處理后石灰性紫色土中AOB占總微生物的百分比的增長(zhǎng)倍數(shù)遠(yuǎn)大于中性紫色土和石灰性紫色土，乙炔抑制處理后則均有不同程度的下降。

三種紫色土各處理AOB主要以Nitrosospira為主，NOB主要以Nitrospira為主，這表明在硝酸鹽氧化過(guò)程中Nitrosospira的活性高于Nitrosomonas，Nitrospira的活性要高于Nitrococcus。Nitrosomonas在高濃度銨環(huán)境下存在，而Nitrosospira在自然環(huán)境中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)，Nitrospira對(duì)亞硝酸鹽的親和力較高［26-28］。NOB的相對(duì)量要大于AOB。在測(cè)序結(jié)果中，門水平未找到氨氧化古菌，因此在文中并沒(méi)有進(jìn)行作圖。經(jīng)典的硝化作用過(guò)程由兩個(gè)步驟完成：氨氧化細(xì)菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）先將氨氧化成亞硝酸鹽，然后亞硝酸氧化細(xì)菌（NOB）將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。氨氧化微生物（AOM）將銨氧化成亞硝酸鹽產(chǎn)生 6 個(gè)電子，較亞硝酸氧化細(xì)菌（NOB）將亞硝酸氧化成硝酸鹽產(chǎn)生的電子量多3倍，由于氨氧化微生物（AOM）代謝時(shí)氨單加氧酶活化銨需要2個(gè)電子，因此氨氧化微生物（AOM）轉(zhuǎn)化每單位氮真正釋放的能量?jī)H較亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB）釋放的多2倍。這意味著理論上環(huán)境中 AOM /NOB 的數(shù)量比是2［29-32］。但本次試驗(yàn)中檢驗(yàn)到的紫色土中的NOB的相對(duì)量要大于AOB。最近有研究表明，Nitrospira屬中的一類能夠進(jìn)行全程硝化作用［5-6］，即能將氨直接氧化為硝酸鹽。本次試驗(yàn)中NOB/AOB的值在三種紫色土各處理中最高可達(dá)到13，這意味著全程氨氧化細(xì)菌（Comammox）可能在紫色土硝化中占據(jù)重要貢獻(xiàn)［5，33］。從熱力學(xué)的角度來(lái)看，在細(xì)菌群落中AOB的數(shù)量應(yīng)該較NOB要多，但很多試驗(yàn)得出的結(jié)論卻與之相反［33-34］。相比于分步的硝化作用，全程硝化作用會(huì)產(chǎn)生出更高的能量，進(jìn)行全程硝化作用的硝化微生物應(yīng)該更適宜生長(zhǎng)。許多已經(jīng)發(fā)表的宏基因組數(shù)據(jù)表明能進(jìn)行全程硝化作用的Nitrospira廣泛分布于土壤、淡水生態(tài)系統(tǒng)、污水處理廠和飲用水處理系統(tǒng)中［5-8］。因此我們需要有更多的工作來(lái)評(píng)估各種硝化微生物在土壤硝化作用中的貢獻(xiàn)。通過(guò)對(duì)此次試驗(yàn)中13C標(biāo)記結(jié)果的后續(xù)探究，我們也可以進(jìn)一步了解各種硝化微生物到底是否在土壤的硝化過(guò)程中發(fā)揮了作用，如果被標(biāo)記，則證明此類硝化微生物在土壤進(jìn)行的自養(yǎng)硝化過(guò)程中起了作用。

4 結(jié) 論

pH較高的中性紫色土（pH=7.2）和石灰性紫色土（pH=8.5）中發(fā)生了強(qiáng)烈的硝化作用，而酸性紫色土（pH=5.3）中未進(jìn)行明顯的硝化作用，并且硝化作用類型均以自養(yǎng)硝化為主。三種紫色土中均存在著變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），其中Proteobacteria在三種紫色土中均大約占有20%的比例。中性紫色土和石灰性紫色土各處理中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）的百分比大于酸性紫色土各處理。三種紫色土中AOB主要以亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）為主，NOB主要以硝化螺菌屬（Nitrospira）為主，且NOB的相對(duì)量大于AOB。

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