唐曉慧，鐘靈允，湯 燾，李文飛，李 興，江 蘭 ，趙 鋼，趙江林*

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106)

蕎麥(Buckwheat)是一種著名的藥食同源小宗雜糧作物，富含蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、礦質(zhì)微量元素、生物黃酮和D-手性肌醇等營(yíng)養(yǎng)功能成分，具有很好的營(yíng)養(yǎng)保健功能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改善和健康意識(shí)的增強(qiáng)，兼具營(yíng)養(yǎng)與保健功效的蕎麥及其加工制品深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[3-5]。近年來(lái)，隨著我國(guó)蕎麥種植面積的不斷擴(kuò)大，蕎麥病害的發(fā)生也呈逐年加重趨勢(shì)，其中由半知菌類絲核菌屬立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的蕎麥立枯病害尤為突出，可導(dǎo)致蕎麥年產(chǎn)量損失高達(dá)15%～20%，嚴(yán)重影響了蕎麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[6-7]。當(dāng)前在蕎麥種植生產(chǎn)過(guò)程中，主要通過(guò)施用多菌靈、代森鋅、福美雙和克菌丹可濕性粉劑等化學(xué)類農(nóng)藥來(lái)防治蕎麥立枯病害[7-8]。隨著長(zhǎng)期大量使用這些化學(xué)類藥劑，勢(shì)必會(huì)引起病原微生物的抗性增強(qiáng)、毒性殘留，以及環(huán)境污染等弊端，因而急需探尋一些新型高效、低毒、環(huán)境友好的殺菌藥物作為替代。植物源殺菌劑作為現(xiàn)代生物農(nóng)藥的一部分，以其低毒、選擇性高、易降解等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景[9-11]。本文研究了6種香料植物提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，以期篩選出具有較強(qiáng)抑菌活性的香料提取物，為蕎麥立枯病等病害新型植物源防治藥劑的開(kāi)發(fā)研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料 八角(IlliciumverumHook.f.)、花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)、辣椒(CapsicumannuumL.)、生姜(ZingiberofficinaleRosc.)、大蒜(AlliumsativumL.)、蔥(AlliumfistulosumL.)，市售。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA(馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g，水1 000 mL)，95%乙醇(成都金山化學(xué)試劑有限公司)，多菌靈(Aldrich公司)。

1.1.2 供試病原菌 蕎麥立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)RS-1(GenBank登錄號(hào)：KP027485)，由成都大學(xué)-農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心提供。實(shí)驗(yàn)前活化使用，將其接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上，放入28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5 d即可。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DFT-100手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；ESJ120-4電子天平；DGG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；SHZ-95B循環(huán)水式多用真空泵；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；W201恒溫水浴鍋；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋；超凈工作臺(tái)；RXZ-PQX人工氣候箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香料植物提取物的制備 原料前處理：將生姜清洗、瀝水、切塊；把鮮蔥去根須、清洗、瀝水、切碎；將大蒜清洗、瀝水、去皮；采用組織勻漿機(jī)對(duì)生姜塊、鮮蔥粒、大蒜瓣進(jìn)行粉碎，分別得到生姜、蔥和大蒜勻漿，將其置于4 ℃冰箱保存，待用。辣椒、花椒和八角經(jīng)挑選、除雜，然后將其置于50～55 ℃干燥箱中烘焙60 min后取出，采用萬(wàn)能粉碎機(jī)分別將其磨碎，過(guò)80目篩，分別得到辣椒、花椒和八角粉末，將其裝入密封袋，置于4 ℃冰箱保存，待用。

乙醇提取物的制備：分別稱取各香料植物粉末或勻漿200.0 g，置于1 000 mL錐形瓶中，按照料液比1∶4(m/v)加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，在50 ℃超聲輔助浸提60 min，過(guò)濾除雜，每種植物樣品提取2次，合并2次濾液，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)各濾液進(jìn)行濃縮至近干，轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿，置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量，得到6種香料植物的乙醇提取物。

1.2.2 提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 采用菌絲生長(zhǎng)速率法(mycelia growth rate)初步檢測(cè)提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用[12]。用分析天平分別準(zhǔn)確稱取4.0 g各香料提取物，用20%的乙醇溶液將各提取物充分溶解，制成0.4 g/mL母液。然后分別移取0.5,0.25,0.125,0.062 5 mL各配制好的母液加入盛有50.0 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的錐形瓶中，制成濃度為4.0,2.0,1.0,0.5 g/L的帶藥培養(yǎng)基，倒皿，待冷卻后在培養(yǎng)皿中央移入蕎麥立枯絲核病菌菌餅(Φ=7 mm)，每皿1個(gè)，每個(gè)處理3次重復(fù)。以蒸餾水為空白對(duì)照(CK)，0.2%乙醇為陰性對(duì)照(CK-)，20.0 mg/L多菌靈為陽(yáng)性對(duì)照(CK+)。隨后將培養(yǎng)皿置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，48 h后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑大小，并根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率。

菌落擴(kuò)展直徑(mm)=菌落平均直徑(mm)-菌餅直徑(7 mm)

(1)

抑制率=(溶劑對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑 -處理菌落擴(kuò)展直徑)/ 溶劑對(duì)照菌落擴(kuò)展直徑×100%

(2)

1.2.3 提取物對(duì)立枯病菌菌絲生長(zhǎng)抑制中濃度IC50值的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度IC50值。在活性初篩基礎(chǔ)之上，選取對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)具有較好抑制作用的幾種香料植物提取物進(jìn)行IC50值的測(cè)定。將4種香料植物提取物分別配制為生姜(0.125,0.25,0.5,1.0,2.0 g/L)、八角(0.5，1.0，2.0，4.0，6.0 g/L)、辣椒(1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 g/L)和花椒(0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 g/L)的各系列濃度帶藥培養(yǎng)基，其活性測(cè)定操作方法同上。根據(jù)所測(cè)定的菌落直徑大小，計(jì)算出各樣品對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。在試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析中，將香料植物提取物濃度(g/L)換算成濃度對(duì)數(shù)(X)，抑制率換算成生物統(tǒng)計(jì)幾率值(Y)，并求得其相關(guān)回歸方程Y=aX+ b，根據(jù)線性方程從而求得抑制中濃度IC50值[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(Statistical Product and Service Solutions)19.0統(tǒng)計(jì)軟件和Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種香料植物提取物得率

采用超聲波輔助浸提結(jié)合真空濃縮的方法對(duì)辣椒、花椒、八角、大蒜、生姜和蔥等6種香料植物的乙醇浸提物進(jìn)行了提取制備。不同香料植物的乙醇提取物得率有較大差異，其得率如表1所示。6種香料植物中大蒜的乙醇提取物得率相對(duì)較高，提取率達(dá)到24.4%，其次為辣椒、花椒、八角和蔥，其得率分別為18.9%，18.1%，12.1%和7.1%，而生姜的乙醇提取物得率相對(duì)最低，僅為2.7%。

表1 6種香料植物乙醇提取物得率

2.2 6種香料植物提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法檢測(cè)了辣椒、花椒、八角、大蒜、生姜和蔥等6種香辛料植物乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌(Rhizoctoniasolani)RS-1菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，其代表性抑制效果如圖1所示。

CK：水；CK-：0.2%乙醇；CK+：20.0 mg/L多菌靈；A：生姜；B：八角；C：辣椒；D：蔥；E：大蒜；F：花椒CK：water;CK-：0.2% ethanol;CK+：20.0 mg/L carbendazim;A：Zingiber officinale:B：Illicium verum;C：Capsicum annuum;D：Allium fistulosum;E：Allium sativum;F：Zanthoxylum bungeanum圖1 6種香料植物提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of six kinds of plant extracts on the mycelia growth of R.solani

植物提取物Plantextract濃度/(g·L-1)Concentration菌落直徑/mmColonydiameter抑制率/%Inhibitoryactivity辣椒0．566．4±1．9bc8．4±1．9lmCapsicumannuum1．061．0±1．5ef15．9±1．8ij2．049．8±1．8h31．2±2．0g4．041．8±2．0i42．4±2．8f花椒0．553．4±1．8g26．3±2．3hZanthoxylumbungeanum1．033．3±0．8k54．0±0．8d2．026．3±1．2l63．7±1．6c4．017．9±0．4m75．3±0．6b八角0．567．3±0．5bc7．1±0．3lmIlliciumverum1．059．1±3．4f18．5±2．4i2．038．0±0．5j47．6±0．7e4．025．3±0．8l65．2±1．1c大蒜0．569．2±0．8b4．6±0．5mAlliumsativum1．067．3±2．5bc7．1±2．8lm2．064．7±1．0cd10．8±1．4kl4．062．3±1．0de14．0±0．6jk生姜0．540．5±0．9ij44．1±0．9efZingiberofficinale1．033．7±1．5k53．6±1．5d2．025．3±1．5l65．1±1．9c4．017．3±1．8m76．1±1．5b蔥0．568．5±2．4b5．5±2．7mAlliumfistulosum1．068．0±3．5b6．2±1．8m2．067．4±0．8bc7．0±0．5lm4．066．5±3．0bc8．3±3．7lm陽(yáng)性對(duì)照CK+0．0±0．0n100．0±0．0a溶劑對(duì)照CK-72．5±3．3a空白對(duì)照CK74．6±0．9a

數(shù)值代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，不同列中的不同字母(a-n)表示在P=0.05水平上有顯著差異。

The values represent means±standard deviation(n=3),different letters(i.e.,a-n) in each column indicated significant differences among the treatments atP=0.05 level.

不同濃度的各香料植物乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率如表2所示。在供試質(zhì)量濃度(0.5～4.0 g/L)范圍內(nèi)，這幾種香料提取物對(duì)蕎麥立枯病菌的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出了一定的抑制效果，其活性大小與提取物類型及處理濃度緊密相關(guān)。6種香料提取物中，生姜和花椒乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性相對(duì)較強(qiáng)，其抑制率分別可達(dá)44.1%～76.1%和26.3%～75.3%。八角和辣椒乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出了一定的抑制活性，在最高濃度4.0 g/L時(shí)，其對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為65.2%和42.4%。而蔥和大蒜的乙醇提取物在供試濃度范圍內(nèi)對(duì)蕎麥立枯病菌的抑制作用相對(duì)較弱，其抑制率均小于15.0%。

2.3 香辛料提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度IC50值

根據(jù)抑菌活性初篩結(jié)果，6種香辛料植物中生姜、花椒、八角和辣椒的乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌表現(xiàn)出了較好的抑制作用，值得深入研究?；诖耍x用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)一步測(cè)定了該4種香料植物提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度IC50值，旨在為其開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。以香料植物提取物對(duì)立枯病菌RS-1菌絲生長(zhǎng)的抑制率-幾率值為縱坐標(biāo)，提取物濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，分別構(gòu)建其線性回歸方程，進(jìn)而分析計(jì)算各香料植物乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的IC50值。圖2(A、B、C、D)分別呈現(xiàn)了生姜、八角、辣椒和花椒4種香料提取物濃度對(duì)數(shù)與其對(duì)蕎麥枯立病菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性的相關(guān)曲線圖。在供試濃度范圍內(nèi)，這4種香料植物乙醇提取物對(duì)立枯絲核病菌RS-1的抑制活性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其濃度-活性線性關(guān)系良好(R≥0.994 3)。

圖2 生姜(A)、八角(B)、辣椒(C)和花椒(D)提取物濃度與其對(duì)蕎麥立枯病菌抑制活性相關(guān)曲線圖Fig.2 Diagrams of correlations between the extract concentration of A.sativum(A),I.verum (B),C.annuum(C) and Z.bungeanum (D) ant their inhibitory activity against R.solani

香料植物Spiceplant抑制活性回歸方程Regressequationandcorrelationcoefficient抑制中濃度/(g·L-1)IC50生姜Y=0．8799X+2．4804 R=0．99730．73八角Y=1．9120X-1．4770 R=0．99612．44辣椒Y=1．6027X-1．0084 R=0．99435．61花椒Y=1．3292X+1．0361 R=0．99700．96

由表3可以看出，生姜、八角、辣椒和花椒4種香料乙醇提取物中，生姜提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性最好，其抑制中濃度IC50值僅為0.73 g/L。花椒提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用次之，其IC50值為0.96 g/L。八角提取物對(duì)蕎麥立枯病菌抑制作用的IC50值為2.44 g/L。而辣椒提取物對(duì)蕎麥立枯病菌RS-1的抑制活性相對(duì)較弱，其IC50值高達(dá)5.61 g/L。

3 結(jié)論與討論

蕎麥立枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一種土傳性真菌病害。該病菌主要在蕎麥幼苗期危害地下種子或幼苗莖基部，引起缺苗斷壟或幼苗萎蔫枯死。立枯絲核病菌主要以菌絲體和菌核在土壤或蕎麥殘?bào)w上越冬，可在土中腐生2～3年。該病菌也可通過(guò)雨水、灌溉水、氣流和農(nóng)具等進(jìn)行傳播，從幼苗莖基部或根部傷口侵入，也可直接穿透蕎麥表皮侵入[6-7]。如何有效控制和減少蕎麥立枯病等病害的發(fā)生？這對(duì)于提高蕎麥產(chǎn)量與品質(zhì)，保障食品安全，帶動(dòng)蕎麥種植地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。因此，本研究選用菌絲生長(zhǎng)速率法檢測(cè)了6種香料植物乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。在供試濃度范圍內(nèi)，這幾種香料植物提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出了一定的抑制效果，其活性大小與提取物類型及處理濃度緊密相關(guān)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。在濃度為1.0 g/L時(shí)，生姜和花椒乙醇提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率超過(guò)了50%，而大蒜和蔥提取物對(duì)立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均低于10%。隨著供試濃度的升高，這幾種香料提取物對(duì)立枯病菌的抑制活性均有所增強(qiáng)。當(dāng)提取物濃度達(dá)到4.0 g/L時(shí)，生姜和花椒提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別高達(dá)76.1%和75.3%，八角和辣椒提取物對(duì)立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為65.2%和42.4%，大蒜和蔥提取物對(duì)立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率僅為14.0%和8.3%。進(jìn)一步通過(guò)活性測(cè)定分析得到生姜和花椒提取物對(duì)蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度IC50值為0.73 g/L和0.96 g/L，八角提取物對(duì)蕎麥立枯病菌抑制作用的IC50值為2.44 g/L，而辣椒提取物對(duì)蕎麥立枯病菌抑制活性相對(duì)較弱，其IC50值為5.61 g/L。

眾多研究[14-19]報(bào)道，香料植物大多具有較好的抑菌作用，其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和食品工業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。本研究結(jié)果表明生姜和花椒提取物能夠有效地抑制蕎麥立枯病菌菌絲生長(zhǎng)，說(shuō)明生姜和花椒2種香料植物體內(nèi)的有效成分對(duì)立枯絲核病菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，展現(xiàn)出了較好的開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值。然而這些提取物及有效成分的理化性質(zhì)、抑菌作用機(jī)制，以及生防效果等方面有待進(jìn)一步深入研究，以期為蕎麥立枯病等病害新型防治藥劑的開(kāi)發(fā)研制提供依據(jù)。

致謝:成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院向達(dá)兵博士對(duì)本研究給與了指導(dǎo)和幫助，謹(jǐn)致謝意！

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