周銀麗，郭建偉，楊 偉，胡先奇

(1．紅河學(xué)院 云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 蒙自 661100;2.紅河學(xué)院 商學(xué)院,云南 蒙自 661100;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650201)

云南蒙自萬(wàn)畝石榴園擁有“中國(guó)石榴之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，然而隨著石榴樹齡的增長(zhǎng)及栽培集約化管理，石榴連作障礙日漸凸顯，各種石榴病害也日益嚴(yán)重[1-2]。其中被果農(nóng)稱為石榴的“癌癥”的枯萎病尤其嚴(yán)重。作為土傳真菌病害的石榴枯萎病，其病原菌甘薯長(zhǎng)喙殼(CeratocystisfimbriataEllis & Halsted)分布廣泛，在我國(guó)主要引起芋頭黑腐病、甘薯黑斑病、石榴枯萎病[3]。我國(guó)云南省蒙自縣、四川省攀西地區(qū)先后發(fā)生了石榴枯萎病[4-6],根部傷口是石榴枯萎病菌的主要入侵通道[7]。枯萎病害石榴園再植石榴難以成活，石榴果園面積在不斷減少，已成為石榴產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的重要限制因子。

目前防治石榴枯萎病主要還是依賴化學(xué)農(nóng)藥，由于化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期使用，引起石榴果實(shí)和環(huán)境污染且導(dǎo)致石榴枯萎病菌產(chǎn)生抗藥性，因此從根本上控制該病害的措施是利用生防微生物拮抗病原菌的同時(shí)對(duì)石榴枯萎病果園衰退土壤進(jìn)行生物修復(fù)，已有的研究表明在石榴枯萎病的防控過(guò)程中土著微生物具有良好的應(yīng)用潛力[8-11]。本研究篩選對(duì)石榴枯萎病菌有較強(qiáng)抑菌作用的芽孢桿菌，為環(huán)保地控制石榴枯萎病提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 根際土樣的采集

采集的土樣類型有石榴枯萎病根際土、健康石榴根際土。將石榴園進(jìn)行區(qū)劃，采用五點(diǎn)取樣法，在每點(diǎn)取樣株3株，從每樣株周圍3處不同的位置采集根系周圍1 cm左右的根際土壤，將3樣株根際土混合為一個(gè)樣本，共采集了45份樣本。

1.2 石榴枯萎病菌拮抗芽孢桿菌的篩選

拮抗芽孢桿菌粗篩：將培養(yǎng)7 d的石榴枯萎病病原菌配制孢子懸浮液，濃度為1×103CFU/mL，取100 μL涂布于PDA平板上，靜置5 h。把從土壤中分離到的芽孢桿菌單菌落用滅菌牙簽接種到涂有病原菌的PDA平板上，接種時(shí)選取不同菌落形態(tài)、不同顏色的芽孢桿菌，以獲得更多的拮抗菌株，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d后，觀察并測(cè)定其抑菌圈的大小。

拮抗芽孢桿菌復(fù)篩：選出初篩對(duì)石榴枯萎病菌有明顯抑制效果的拮抗芽孢桿菌，再用平板對(duì)峙法進(jìn)行復(fù)篩，保存拮抗效果好的芽孢桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 石榴枯萎病菌拮抗芽孢桿菌的定植能力研究

在溫室中準(zhǔn)備好無(wú)菌土盆栽石榴苗，按期施肥澆水，待石榴苗生長(zhǎng)至一年期。對(duì)拮抗菌株進(jìn)行利福平抗性標(biāo)記，將利福平抗性菌株接種于LB培養(yǎng)液中，搖床中150 r/min和37 ℃條件下培養(yǎng)至濃度達(dá)1×107CFU/mL，取菌懸液100 mL，采用澆灌法接種在石榴苗根際土壤中，3個(gè)重復(fù)，定期澆水施肥，常規(guī)管理。

定殖能力的測(cè)定 施入菌懸液后，每隔5 d取樣1次，共取樣7次，即分別于第5、10、15、20、25、30和35天取樣調(diào)查根部土壤中拮抗菌株的數(shù)量。取根際土樣，制備土壤樣品10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的系列稀釋液，選擇10-4、10-5和10-6的稀釋液，分別移取樣品200 μL均勻涂布于含利福平(200 μg/mL)的LB平板上，每個(gè)梯度3次重復(fù)，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后分別統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)。定殖密度計(jì)算：

定殖密度(CFU/g)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

(1)

1.4 石榴枯萎病菌拮抗細(xì)菌的生化鑒定

鑒定步驟：(1)菌種活化：將待測(cè)菌種放在培養(yǎng)基上活化，33 ℃下培養(yǎng)24 h；(2)菌種純化：將活化好的菌種在培養(yǎng)基上稀釋劃線，33 ℃下培養(yǎng)24 h，以獲得單個(gè)菌落；(3)在Biolog專用的培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，將獲得的純培養(yǎng)菌種接種至Biolog專用的培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)24 h；(4)準(zhǔn)備預(yù)期濁度的接種物，在Biolog專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌種，沾取一個(gè)單菌落即可，將棉簽的末端深入裝有接種液的接種管的底端，并來(lái)回上下晃動(dòng)，以便將細(xì)菌釋放到接種液中，且按要求配制一定濁度(細(xì)胞濃度)的菌懸液，用濁度儀檢測(cè)；(5)接種微孔板：將菌懸液倒入V型加樣水槽中；使用8道移液器將菌懸液吸入移液器吸頭中；按每孔100 μL的量將菌懸液按順序加入微孔板的所有孔中；(6)孵育微孔板：將微孔板直接放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～36 h。培養(yǎng)溫度33 ℃，或者如第一步中提到情況下在更適合微生物生長(zhǎng)的其他溫度下培養(yǎng)；(7)讀板并記錄：將培養(yǎng)后的鑒定板放入讀數(shù)儀中讀數(shù)，軟件自動(dòng)給出鑒定結(jié)果。

1.5 石榴枯萎病菌拮抗芽孢桿菌的分子鑒定

用OMEGA細(xì)菌基因組試劑盒提取細(xì)菌DNA，提取操作步驟按照說(shuō)明進(jìn)行，可得到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA。用細(xì)菌gyrB的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆，陽(yáng)性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴枯萎病菌拮抗芽孢桿菌的篩選及定植能力

本研究從云南建水石榴園和蒙自萬(wàn)畝石榴園共采集了45個(gè)土壤樣本，初步篩選得到26株拮抗石榴枯萎病菌的芽孢桿菌，進(jìn)一步用平板對(duì)峙法復(fù)篩，共得到對(duì)石榴枯萎病菌拮抗活性明顯的芽孢桿菌10株，其中拮抗菌A4對(duì)石榴枯萎病菌抑制率為55.29%(圖1)。

圖1 菌株A4對(duì)石榴枯萎病菌的拮抗效果Fig.1 Antifungal plate of A4 against Ceratocystis fimbriata(A、B) and the control(C)

利福平抗性標(biāo)記菌株A4在石榴苗根際第5、10、15、20、25、30和35天的回收菌量為6.5×103、5×104、1.8×104、1.8×104、1.2×103、1×103和1.3×103，利福平抗性菌株A4在石榴根際的定殖密度第1次取樣時(shí)出現(xiàn)下降，第2次取樣時(shí)菌量上升，第3次、第4次取樣時(shí)定殖密度維持穩(wěn)定，第5次取樣時(shí)又有下降，之后在石榴根際的定殖密度趨于穩(wěn)定，表明菌株A4能在石榴根際穩(wěn)定定植。

2.2 菌株A4的生化鑒定

菌株A4對(duì)Biolog板上95種碳底物的利用能力統(tǒng)計(jì)結(jié)果。單糖：能完全反應(yīng)的有12種，半反應(yīng)的有12種，未反應(yīng)的有2種；磷酸己糖：兩種都為半反應(yīng)；氨基酸：完全反應(yīng)有4種，半反應(yīng)有5種；己糖羧酸：完全反應(yīng)有6種，半反應(yīng)有3種；酸、酯和脂肪酸:完全反應(yīng)有4種，半反應(yīng)的有12種，未反應(yīng)的有2種(表1)。最后鑒定結(jié)果與菌株Bacillusatrophaeus的相似值為：0.674(相似值>0.500為有效鑒定)。

2.3 石榴枯萎病菌拮抗芽孢桿菌的分子鑒定

通過(guò)PCR擴(kuò)增方法得到菌株A4的gyrB基因，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆，測(cè)序獲得菌株A4的gyrB基因近全長(zhǎng)序列。Blast相似性分析表明，菌株A4與萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus的gyrB基因序列同源性為99%，建立系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)菌株A4與萎縮芽孢桿菌處于同一分支(圖2)，結(jié)合該菌株在細(xì)菌鑒定版上的鑒定結(jié)果與菌株B.atrophaeus的相似值為：0.674(相似值>0.500為有效鑒定)，將A4菌株鑒定為萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus。

表1 菌株A4對(duì)Biolog板上95種碳底物的利用能力

圖2 以gyrB基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的A4菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of A4 based on gyrB gene sequence

3 結(jié)論與討論

石榴枯萎病號(hào)稱石榴的“癌癥”，是一種難防的土傳真菌病害，石榴枯萎病現(xiàn)以“蠶食”的形式在危害石榴果園，是影響石榴產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的一個(gè)重要限制因子，而現(xiàn)在生產(chǎn)上使用的化學(xué)農(nóng)藥，造成了農(nóng)藥殘留及污染環(huán)境，無(wú)法滿足人們對(duì)食品安全及環(huán)境保護(hù)的迫切需求。本研究采用稀釋平板涂布及對(duì)峙培養(yǎng)法，共篩選到對(duì)石榴枯萎病菌有較強(qiáng)抗性的芽孢桿菌10株，其中拮抗芽孢桿菌A4對(duì)石榴枯萎病菌的抑制率為55.29%，且該菌株能在石榴根際土壤穩(wěn)定定植，具有潛在的生防價(jià)值。菌株A4與萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus的gyrB基因序列同源性為99%，建立系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)菌株A4與萎縮芽孢桿菌處于同一分支，結(jié)合A4菌株在細(xì)菌生化鑒定版上的鑒定結(jié)果，將A4菌株鑒定為萎縮芽孢桿菌B.atrophaeus。

萎縮芽孢桿菌作為拮抗菌有很多報(bào)道，劉丁等[12]研究報(bào)道了花生抗性、抗病能力提高可在一定程度上被萎縮芽孢桿菌誘導(dǎo)。薛鵬琦等[13]分別從西藏日喀則地區(qū)和拉薩地區(qū)雜草根圍土壤中篩選到對(duì)油菜菌核病菌有顯著拮抗活性的萎縮芽孢桿菌菌株RJGP16，該菌株對(duì)油菜菌核病菌防治效果為50.24%。朱文靜等[14]研究報(bào)道了大豆發(fā)芽及生長(zhǎng)可被枯草芽孢桿菌SYST2和萎縮芽孢桿菌LSSC3制備的種衣劑顯著促進(jìn)。溫室盆栽試驗(yàn)表明這2種生物種衣劑對(duì)大豆進(jìn)行處理，對(duì)大豆根腐病有較好的防治作用。辛海峰等[15]從小麥葉片中篩選獲得了一株抗赤霉病菌株XM5，鑒定其為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。本研究表明，萎縮芽孢桿菌A4對(duì)石榴枯萎病菌有較好的抑制效果，該菌株能在石榴根際土壤穩(wěn)定定植，有潛在的開發(fā)利用價(jià)值。石榴枯萎病的有效防控不可能依賴一兩株生防菌，找到更多的生防菌，并將其進(jìn)行合理組合，在控制石榴枯萎病的同時(shí)，改善失衡的土壤微生態(tài)環(huán)境，是有效防控石榴枯萎病的努力方向。

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